农杆菌介导石斛兰遗传转化的研究

利用根癌农杆菌介导转化石斛兰类原球茎（PLBs），研究了石斛兰对潮霉素的敏感性，并通过gus瞬时表达率比较不同类型农杆菌、侵染液浓度及乙酰丁香酮（AS）等对石斛兰转化的影响。结果表明：带有pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（简称为E1301）比带有相同表达载体的LBA4404（简称L1301）对石斛兰的转化效率更高，前者约为后者的6倍；较高浓度的侵染液转化效率更高（OD600为1．0或1．2时的转化效率约为OD600为0．6或0．8时的2倍）；在农杆菌生长至OD600值为0．8时，添加AS可提高转化效率；而当OD600为0．6、1．0和1．2时，添加AS反而不同程度地降低转化效率；在各种处理中，OD600为1．0时不添加AS的转化效率最高，达44．4％。经过5—6个月选择培养，抗性小苗经GUS染色、PCR和Southern杂交检测证明为转基因植株。

富含多糖的转基因石斛基因组DNA提取方法(英文)

在石斛兰转基因研究中,需通过PCR和Southern杂交等手段检测外源基因是否转入并整合到转化植株基因组。由于转化石斛植株生长缓慢,且含有多糖,因此从转化植株中提取高质量的基因组DNA以尽快对转基因苗进行分子检测存在较大困难。本研究旨在通过改良现有的DNA提取法(CTAB法或SDS法),克服转化石斛植株基因组DNA提取中碰到的产量低,纯度不高而导致难以进行PCR或酶切等问题。在本研究所用的3种改良法中,方法Ⅱ能从少量的转化石斛苗中提取出高产量和高纯度的基因组DNA。研究结果表明方法Ⅱ提取的基因组DNA完全适用于转基因石斛的外源基因PCR扩增,限制性酶切和Southern杂交分析。

非洲菊愈伤组织诱导和不定芽分化研究

以非洲菊深圳5号为材料,研究了几种因素对非洲菊花托愈伤组织诱导和不定芽分化的影响,结果表明,花托在1/2MS+6-BA 10 mg/L+NAA 0.2 mg/L+IAA 0.3 mg/L培养基中诱导愈伤组织的速度最快,诱导率达100%;花托在在1/2MS基本培养基中诱导出的愈伤组织较少褐变,且易分化不定芽;将愈伤组织转接到1/2MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.2mg/L+IAA 0.1 mg/L培养基中进行继代增殖培养可有效降低褐化率,不定芽分化率达67.5%、不定芽平均数为2.3株,指出高效的愈伤组织和不定芽再生频率为非洲菊基因转化体系的建立奠定了基础。

双重RT-PCR同时检测兰花两种主要病毒的研究

以利用Trizol试剂盒提取的蝴蝶兰组培苗叶片总RNA为模板,根据已报道的建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglussm ringspot virus,ORSV)外壳蛋白基因(cp)的保守序列设计特异性引物,探索RT-PCR反应条件,建立了可同时检测CyMV和ORSV的双重RT-PCR体系。

灵芝多糖的微波法提取及抗氧化活性研究

采用单因子和正交实验优化灵芝子实体粗多糖微波法提取工艺和硫酸蒽酮比色法,建立了灵芝子实体粗多糖微波提取和检测方法。过60目筛的粉末作为样品,预浸1.5 h,水提液pH 8.0,料水比1∶70,微波功率400 W,微波时间20 min,提取2次,然后采用90%硫酸-蒽酮法,水浴10 min进行多糖比色检测。通过多糖清除DPPH自由基的实验,初步探讨了微波法提取灵芝多糖的抗氧化能力。

植物细胞的形态建成

从控制细胞形态建成的通用机制,影响形态建成的因素和形态建成的调节3个方面介绍近年来植物细胞形态建成的进展。细胞壁组分和结构的修饰改变是细胞形态建成的关键;细胞骨架的组装和活性,以及膨压的变化对于细胞的形态建成有着重要的作用。

苏云金芽孢杆菌aiiA基因载体构建及石斛兰转化

细菌性软腐病是石斛兰及其它兰花栽培和生产中的一大危害。苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)中含有aiiA基因,该基因转入一些植物可赋予植物表现出软腐病抗性。从Bt菌中克隆出aiiA基因,并装载入植物表达载体pCAMBIA1301,构建出可用于转入石斛兰的pSAN载体;首次利用根癌农杆菌EHA105将pSAN载体转入石斛兰,并获得潮霉素抗性苗。这些抗性苗经GUS组织化学染色和PCR检测证实为转基因苗,这将为获得具有软腐病抗性的石斛兰品种打下基础。

石斛兰dfr基因植物表达载体的构建

石斛兰花瓣缺乏橙色、蓝色,这与其二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)活性有着密切的关系。根据已报道的石斛兰dfr基因序列设计引物,从Den.Burana Emerald中分离了dfr基因。将该基因序列正向与反向连接到植物表达载体pCAM BIA1301中,并由组成型启动子CaMV35S驱动,成功构建了dfr基因的正义和反义植物表达载体pC-SDN1和pCSDN2,并导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)EHA105,以期利用转基因技术培育出石斛兰花色新品种。

珠海灵芝栽培基质配方的筛选研究

为筛选出适合珠海地区灵芝栽培的基质配方,采用不同木屑原料、不同配比等进行灵芝优良菌株的栽培研究。研究结果发现,以台湾相思为木屑原料以及木屑与棉籽壳的比例为1:1时,灵芝的菌丝生长、子实体形态特征、产量和有效成分等4项综合性状最优。综合来看,珠海本地的灵芝高产栽培基质配方为:木屑35%,棉籽壳35%,麦麸20%,玉米粉6%,糖1%,石膏1%,碳酸钙1%,磷酸二氢钾1%。此配方含水量60%。

芒果木屑栽培灵芝试验

为有效利用当地适生树种芒果的木材废料,变废为宝,以芒果木屑作为基质主要木材原料,加入棉籽壳、麦麸等辅料以代料栽培方法进行栽培灵芝试验。结果表明:芒果木屑适合作为灵芝栽培基质木材原料,最适的代料栽培基质配方为:芒果木屑69%、棉籽壳10%、麦麸20%、硫酸钙1%,培养基含水量60%,芒果木屑粉碎成直径≤5mm的颗粒。

蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌IAA细菌的筛选

为从蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)根部分离出可分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌,通过探讨蝴蝶兰根部表面消毒的最佳条件,采用分离培养法、生理生化试验和16S rDNA分析,对蝴蝶兰根部内生细菌进行研究。结果表明,NA培养基分离出的6株细菌分别属于短杆菌属(Brevibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Dyella和类芽胞杆菌(Paenibacillus);R2A培养基分离出的20株细菌分别属于伯克氏菌属(Burkholderia)和Dyella;分离获得的26株内生细菌中,具有分泌IAA功能的有23株,占分离总菌数的88.5%。综合来看,蝴蝶兰根中存在可分泌IAA不同种属的内生细菌,为进一步研究内生细菌与蝴蝶兰植物之间的相互作用提供了菌种资源。

珠海灵芝周年无害化设施栽培技术

从珠海灵芝生产实际出发,着重针对原料存放、基质灭菌、无菌接种、周年生产设施、菌丝培养、出菇管理、病虫害无害化防治等方面进行阐述,总结出一套灵芝周年无害化设施栽培技术要点。

珠海优良灵芝品种的筛选研究

采用代料栽培方式,在珠海对26个灵芝品种进行筛选品比试验。结果表明,美国灵芝类C1和C8菌株的菌丝生长快,产量较其他品种高,菌盖和子实体等综合性状良好;另外,C8子实体的多糖、三萜和有机锗等药效成分含量比C1高。综合来看,美国灵芝C8菌株在生长特性、商品性状和药效成分含量等方面均优于其他灵芝品种,是适合珠海栽培种植的优良灵芝品种。

荧光AFLP和拮抗实验对灵芝菌遗传多样性研究

应用荧光AFLP和拮抗实验对26株灵芝菌种进行了遗传多样性分析。荧光AFLP分析的结果表明，采用9对EcoRI／MseI引物（其中MseI引物为FAM荧光标记物）对26个菌株进行AFLP扩增，共得到1944条清晰易辨的多态性条带。聚类分析表明，26株灵芝菌株在遗传相似系数0．28处聚为3类，分别是美国灵芝类、赤芝类和树舌类。种间的遗传相似系数变化范围在0．23—0．73。荧光AFLP分析结果与拮抗性实验结果基本一致，可见拮抗试验在灵芝亲缘关系的初步鉴定中是有效的，荧光AFLP则更能区分出亲缘关系较近的灵芝菌株。

从富含多糖的石斛兰花蕾中提取总RNA初探

石斛兰花蕾中含有大量多糖,干扰RNA的提取与纯化。研究表明,采用含高盐的1.5%SDS裂解液,配合LiCl沉淀RNA,去除多糖类物质,获得了完整性好、质量高的RNA,完全适用于后续的分子生物学研究。

种子中脱落酸的研究进展

脱落酸在种子中的活动主要表现为合成、代谢、运输和反应.综述了种子中脱落酸含量变化、合成、信号转导途径中的调控酶及转录因子、脱落酸与种子休眠关系的研究进展.

碱蓬对盐碱地的生态修复探索性研究

以盐地碱蓬为主要研究对象,结合珠海的实际情况和盐渍土特点,开展耐盐碱碱蓬对珠海农发中心实验大棚盐碱地的生态修复探索性研究,最终探讨盐地碱蓬是否适合广泛应用于本地及周边盐碱地的生物修复。为实现滨海盐碱土的改良打下基础,为盐碱地的生物修复和农林业开发利用提供科学依据。

石斛兰dfr基因的克隆、序列分析及原核表达

二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)在不同花色形成中起着关键作用。利用RT-PCR方法从石斛兰中克隆出dfr基因,并命名为Dendfr。该序列全长1164bp,编码352个氨基酸。氨基酸序列分析发现,DenDFR与3种兰科植物的DFR氨基酸序列同源性达81%～86%,与其他非兰科植物的DFR氨基酸同源性在56%～72%之间。在DenDFRN-末端存在一个保守的NADP结合区,序列中存在26个氨基酸组成的底物特异结合区,其中134位氨基酸处存在特异的天冬酰胺N位点。将Dendfr的编码区克隆到pQE30载体中,在大肠杆菌中高效表达了该蛋白,为进一步研究石斛兰花色形成机制及花色改良基因工程打下基础。