脱细胞异种角膜基质的制备及细胞相容性

目的用牛角膜制备脱细胞基质,作为组织工程角膜的载体,为细胞提供贴附生长的支持物。方法选取新鲜牛角膜9个,每个分层剥离为2片组织。用0.25%胰蛋白酶,37℃下分为20、40、60min消化,漂洗。每组取样本分别做扫描电镜观察和HE染色观察。其余冻干处理后消毒备用。将消毒后冻干牛角膜基质常规培养基浸泡24h,取浸提液原液,稀释101、102、103倍培养人成纤维细胞,观察细胞生长情况。将冻干牛角膜基质复水,常规培养基浸泡24h,以2×105个/cm2接种兔角膜缘细胞,培养7d后,标本扫描电镜检查、HE染色观察。结果电镜观察各组牛角膜片表层细胞均被脱去,60min组基质胶原间细胞碎片残留较少,20min组较多,胶原纤维有序排列以60min组破坏最大。浸提液的各稀释倍数及原液所培养人成纤维细胞生长良好,各组间差异无显著性。电镜及HE染色观察复合材料培养的兔角膜缘干细胞,均见细胞在材料表面贴附生长,材料部分表面呈多层生长。结论以酶消化法和冻干处理的脱细胞牛角膜基质可以作为细胞的载体在体外与细胞复合培养。

两种生物衍生材料修复兔角膜浅层缺损的初步实验研究

目的比较脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质在修复兔角膜浅层缺损后的机体反应,以寻找适合的组织工程角膜支架。方法新鲜健康人胎盘羊膜按罗静聪等制备方法处理,冻干后消毒备用。牛角膜经0.25%胰蛋白酶消化,生理盐水漂洗后,冻干,消毒备用。雌性日本大耳白兔20只,随机分为A、B组,每组10只。常规麻醉消毒后,采用7.5mm直径环钻造出约1/3角膜厚度的缺损。A组采用复水后的脱细胞冻干羊膜修复;B组采用脱细胞冻干牛角膜基质修复。术后裂隙灯显微镜下观察植片和新生血管状况,并于术后2、4、8周取标本,HE染色,组织学观察。结果术后两组植片无溶解、脱落,于8周降解完全,角膜中央缺损区域大部分恢复透明。两组均有新生血管长入角膜,两组新生血管长入范围比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组织学观察2周时两组均有较重的炎性反应,成纤维细胞增生,胶原排列紊乱;4周时炎性反应均减轻,植片区域可以见到新生血管长入;8周时均有较多的成纤维细胞存在,并有少量瘢痕形成。结论脱细胞冻干羊膜与脱细胞冻干牛角膜基质修复角膜浅层缺损,仍能引起一定程度的排斥反应,需要进一步的改进。

中药骨康方对体外培养大鼠成骨细胞骨架保护作用的初步实验研究

目的：探讨在离心力作用下中药骨康方对大鼠成骨细胞微丝结构的保护与修复作用。方法：选用成年新西兰白兔,分2组分别灌服中药骨康方及戊酸雌二醇,制备中药骨康方和雌激素的含药血清。原代培养大鼠成骨细胞,制备细胞爬片,分为中药骨康方血清培养组（中药组）,雌激素血清培养组（西药组）、不含药血清组（对照组）以及空白组。中药组、西药组及对照组3组细胞分别在240 g、200 g离心力下离心4 min,空白组不离心,离心后培养24 h以多聚甲醛固定各组细胞,鬼笔环肽荧光染色后,于共聚焦显微镜下观察。每张细胞爬片随机取5个视野,每个视野5-7个细胞,计算平均荧光值,并作统计学计算,P〈0.05为有统计学意义。结果：不同离心力作用下,中药组、西药组细胞与对照组细胞比较荧光强度明显较强,且差异有统计学意义（P〈0.001）。中药组与西药组中,240 g离心力与200 g离心力相比,前者细胞微丝荧光强度显著减弱（P〈0.001）;中药组与西药组相比,200 g时,中药组细胞微丝荧光强度强于西药组细胞,有统计学意义（P〈0.001）;240 g时,西药组细胞微丝荧光强度强于中药组细胞,且有统计学意义（P〈0.001）。结论：离心力作用下,中药骨康方含药血清对大鼠成骨细胞的微丝结构由保护和修复作用,但随着离心力的加大,该作用有限。

视黄醇酸受体拮抗剂LE135诱导大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化

用成体干细胞修复软骨损伤是目前的研究热点,其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以诱导成软骨细胞,转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)可以通过活化成软骨标志物诱导BM-MSCs成软骨,但分化软骨细胞容易肥大且生长因子可能引发免疫反应。

组织工程化肌腱植入体内的研究进展

组织工程化肌腱修复肌腱韧带缺损及功能重建是目前的研究热点。所选用的支架材料不仅要对人体无毒副作用 ,还要求其易于细胞黏附 ,能诱导胶原沉积 ,新腱形成 ,并具有接近正常肌腱的力学性能。近年的研究发现 ,随着支架材料在体内的降解及其腱化 ,植入的组织工程化肌腱的力学性能也有所改变。胶原生成。

生物衍生骨复合骨髓基质干细胞修复山羊胫骨缺损的血管化研究

目的 研究生物衍生骨与骨髓基质干细胞 ( marrow stromal stem cells,MSCs)复合修复山羊胫骨缺损的血管化过程 ,了解其修复长段管状负重骨缺损的血管化情况。 方法 制备生物衍生骨作为支架材料 ,培养、诱导MSCs作为种子细胞 ,二者在体外复合构建组织工程骨。 2 0只山羊双侧胫骨中段制备成 2 0 mm长的骨 -骨膜缺损模型 ,采取自身左右侧对照 ,实验侧 (右侧 )缺损处植入组织工程骨 ,对照侧 (左侧 )植入单纯支架材料 ,采用钢板内固定。术后2、4、6及 8周用墨汁灌注透明标本及血管面积图像分析方法观察血管化过程 ,组织学观察血管形成及成骨情况。 结果术后 2、4周 ,实验侧血管形成较对照侧少 ( P<0 .0 5 ) ;术后 8周 ,两侧均完全血管化 ,差异无统计学意义 ( P>0 .0 5 )。实验侧于术后 6、8周新骨形成逐渐增加 ,材料降解吸收较对照组快 ;对照侧术后 8周材料孔隙内仍无明显新骨形成。 结论 生物衍生骨作为骨组织工程的支架材料 ,能够较快发生血管化 ;

骨髓基质干细胞在等离子体处理PEGDA基凝胶表面的黏附和增殖

通过低温等离子体技术对聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)/甲基丙烯酸β-羟乙酯(HEMA)共聚物水凝胶生物材料进行表面改性,以骨髓基质干细胞(BMSc)为细胞模型,考察了细胞在等离子体表面改性前后的水凝胶材料的黏附和增值行为.材料的表面性能通过X射线光电子能谱、接触角和扫描电镜进行表征.研究结果表明,材料表面经氩等离子体处理后,其亲水性得到较大的改善,表面自由能由45.9 m J/m2增加到70.3 m J/m2;体外实验结果证明,BMSc在等离子体处理后材料表面培养24 h后出现明显细胞核,168 h细胞融合成片,通过等离子体处理方法有利于细胞在水凝胶材料表面的黏附和增殖.

工程化肌腱修复肌腱缺损后力学特性的组织学基础

探讨组织工程化肌腱修复肌腱缺损后体内愈合过程中力学特性的组织学基础。取罗曼鸡肌腱细胞 ,经体外培养、扩增 ,与可降解生物材料聚羟基乙酸筛网构建工程化肌腱 ;将其植入修复 2 0只罗曼鸡第二趾深屈肌腱0 .5～ 0 .8cm缺损。术后第 2、4、6、8周取材 ,对标本进行大体、组织学及生物力学测定。植入 2、4、6、8周 ,新生肌腱在大体形态、细胞及胶原纤维排列方式上与正常肌腱相似 ,但新生肌腱的胶原纤维束并未形成较多的沿肌腱长度方向的致密结构 (“塑形”) ,导致其最大张力增加缓慢 ,到 8周时为 15 .4 0± 10 .6 3N,仅达正常肌腱的 2 3 ;8周时最大张应变为 2 2 .4 9± 10 .2 1 ,比正常肌腱大 10。结果表明 ,单纯聚羟基乙酸作支架 ,材料降解过快 ,新生肌腱失去了正常的力学刺激 ,“塑形”能力差 ,其生物力学强度低。提示 ,保持新生肌腱形成过程中正常的力学刺激对新生肌腱的“塑形”可能是至关重要的。

自由基聚合法制备聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶

以过二硫酸胺(APS)/四甲基乙二胺(TMEDA)氧化-还原体系为引发体系,通过活性自由基溶液聚合法制备了交联网状聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)共聚物水凝胶支架,探讨了APS/TMEDA的引发聚合机理。研究结果表明,单体分子量越大,凝胶化时间越短,凝胶化时间随着PEGDA单体浓度的增大、温度的升高和加速剂用量的增大而减小。研究了不同单体浓度对水凝胶溶胀度及力学性能的影响,结果表明,单体溶液浓度越大,水凝胶的平衡溶胀率越小、压缩模量越强。

改良载体提高大鼠成肌细胞移植效率

目的:观察含1g/L透明质酸钠的F12培养基能否提高成肌细胞移植效率和促进组织修复。方法:实验于2003-9/2004-10在四川大学华西医院修复重建实验室完成。①选取5月龄SD大鼠84只,建立胫前肌的深度冻伤的动物模型。②术后第10天,再次手术暴露冻伤肌组织。随机分为4组:取42只,左侧胫前肌注射以含1g/L透明质酸钠的F12培养基为载体的成肌细胞为左侧成肌细胞组;右侧胫前肌注射以F12培养基为载体的成肌细胞为右侧成肌细胞组;另42只,左侧注射含1g/L透明质酸钠的F12培养基溶液为培养液组;右侧不予注射为空白组。③各组分别于术后第2,5,9天,2,4,8,12周取材观察肌质量变化及组织学改变;于术后第2,5,9天进行磷酸肌酸激酶及同工酶测试。结果:84只大鼠均进入结果分析。①各组胫前肌肌质量变化:术后第2天和第5天,空白组肌质量最轻(P<0.05),其余组间差异无显著性(P>0.05)。术后第9天及第2,4,8,12周,左、右侧成肌细胞组肌质量明显高于培养液组和空白组(P<0.05),而左、右侧成肌细胞组之间、培养液组和空白组之间差异无显著性(P>0.05)。②组织学观察:两组移植细胞均分化形成肌纤维,参与组织修复。透明质酸钠还促进早期小血管的再生。③磷酸肌酸激酶及磷酸肌酸激酶同工酶含量:运用两种载体的成肌细胞移植,冻伤组织中的磷酸肌酸激酶及同工酶活性明显增高(P<0.05),显示移植细胞在冻伤局部增殖、分化参与受损组织的修复,以含透明质酸钠溶液为载体的移植组成肌细胞参与修复的总体活性较高。结论:成肌细胞移植对冻伤的肌肉组织有明显的修复作用,以透明质酸钠的溶液为载体可以提高成肌细胞移植效率。

组织工程化肌腱修复鸡趾屈肌腱缺损的生物力学特性研究

组织工程化肌腱植入体内修复的肌腱其抗拉强度达不到正常肌腱的数值。为探讨这一问题的原因 ,我们选择罗曼雏鸡足趾屈肌腱细胞与可降解聚羟基乙酸筛网体外复合培养构建组织工程化肌腱。用此工程化肌腱修复 2 0只罗曼鸡第二趾深屈肌腱 0 .5～ 0 .8cm缺损。术后第 2、4、6、8周取材 ,测定样品中材料的重量、羟脯氨酸含量及抗拉强度等力学特性指标。结果显示 ,植入 2、4、6、8周 ,支架材料重量下降很快 ,至第 8周基本降解 ;修复的肌腱中代表胶原合成总量的羟脯氨酸含量随时间增加 ,但变化不明显 ;修复的肌腱断裂能量和抗拉强度均随时间呈一先降低后逐渐增大的变化 ,抗拉强度在第 8周才达到正常肌腱的 2 3%。结果提示 ,植入的组织工程化肌腱在其材料迅速降解的同时 ,胶原生成量并不多 ,二者出现明显的不匹配 。

整合素α_5β_1在成骨细胞与生物衍生材料黏附过程中的表达

背景:整合素在细胞与材料的黏附过程中发挥重要作用。目的:了解整合素α5β1在成骨细胞构建组织工程骨和组织工程骨膜过程中的表达,探讨在成骨细胞与生物衍生材料黏附过程中整合素α5β1发挥的作用。方法:选用人胚骨膜来源成骨细胞为种子细胞,接种生物衍生骨及羊膜支架材料上,制备组织工程骨及骨膜,分别培养2,4,6,8,10d。单纯培养的成骨细胞作为对照组。结果与结论:实时定量PCR测定结果,培养早期整合素α5表达呈阴性,整合素β1组织工程骨中的表达略高于组织工程骨膜,培养2,6d组比较差异有显著性意义。单纯细胞培养的对照组中,整合素β1稳定,各时间段比较差异无显著性意义。提示生物衍生材料有利于成骨细胞黏附,但在黏附过程的初期,成骨细胞可能是通过纤维连接蛋白以外的其他蛋白质完成该过程的。

甲状旁腺激素对大鼠骨髓间充质干细胞钙离子的影响

背景:甲状旁腺激素可通过靶器官表面的特异性受体激活一系列生理生化反应,调节钙的动态平衡。目的:观察甲状旁腺激素对骨髓间充质干细胞内钙离子的影响,探讨其维持骨髓间充质干细胞体外增殖的机制。方法:将第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞分组培养,实验组加入含甲状旁腺激素的培养基,对照组加入常规培养基,培养10 d内,MTT法检测细胞增殖;培养7,14 d,通过激光共聚焦显微镜观察实验组及对照组细胞内钙离子荧光峰值。结果与结论:①细胞增殖:培养第一二天,2组细胞生长活性均滞缓,3 d后进入快速增长期,在第七八天进入平台期,第10天细胞增殖能力有减弱趋势,其中对照组细胞增殖能力低于实验组(P<0.05);②激光共聚焦显微镜观察结果:两组于培养第7天可见胞内呈现较强的钙荧光峰值,随着诱导时间延长,14 d的细胞内钙荧光峰值出现下降,实验组培养7,14 d的细胞内的钙荧光峰值强于对照组(P<0.001),且实验组14 d的细胞内钙荧光峰值与对照组7 d的细胞内钙荧光峰值无差异;③结果表明:甲状旁腺激素可增加骨髓间充质干细胞内钙离子荧光峰值,维持骨髓间充质干细胞增殖功能。

创伤性深静脉血栓形成大鼠模型Wnt信号通路的作用

背景:创伤后深静脉血栓形成具有潜在的临床危害性,可并发肺栓塞、脑栓塞。Wnt信号途径调节控制多种疾病过程,可能影响深静脉血栓的形成。目的:探讨Wnt信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。方法:将30只SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。模型组根据造模后的不同生物学状态再分为高峰期血栓形成组和高峰期血栓不形成组,造模后5d无创切取股静脉血管组织,随后抽取各组大鼠总RNA,用Genechip Rat Genome 230 2.0芯片测定股静脉RNA表达,并分析Wnt信号通路基因表达变化情况。结果与结论:与正常对照组比较,血栓形成组发现1906个基因出现表达差异,无血栓形成组差异表达基因数目合计1568个;与无血栓形成组比较,血栓形成组有437个出现表达差异,其中Wnt信号通路卷曲相关蛋基因、膜联结合蛋白基因、酪蛋白激酶Ⅱ基因、p53基因、蛋白磷酶2A基因、环腺苷酸依赖性激酶同功酶基因、连接素β基因、原癌基因、fos相关抗原基因、Rac基因、钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ基因、钙调神经磷酸酶基因等均上调;卷曲蛋白基因、磷脂酶C基因等下调。提示Wnt信号通路可能是调控血栓的生物学状态的重要信号通路之一。

创伤后深静脉血栓形成中的黏着斑激酶信号通路

背景:创伤后深静脉血栓形成的分子机制复杂,黏着斑激酶信号通路在深静脉血栓形成过程中的作用尚未阐明。目的:探讨黏着斑激酶信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。方法:取20只SD大鼠制备股骨骨折模型。造模后5d,根据血栓形成情况将模型大鼠分为2组:血栓形成组和无血栓形成组,每组10只。另取10只正常大鼠作为对照组。无创切取大鼠股静脉血管组织,抽取总RNA,Genechip Rat Genome4302.0芯片测定股静脉RNA的表达,并分析黏着斑激酶信号通路基因表达的变化。结果与结论:与无血栓形成组比较,血栓形成组中黏着斑激酶信号通路细胞外基质、蛋白激酶C、Fyn、辅肌动蛋白、Vav等关键基因均上调;下调的有整联蛋白α、肌球蛋白轻链磷酸酶、c-Jun基因。结果提示黏着斑激酶信号通路可能是调控血栓生物学状态的重要信号通路。

58S生物玻璃/壳聚糖复合多孔支架材料的制备

背景:在前期研究的基础上用壳聚糖溶液与纯的58S生物玻璃支架进行复合,通过体外测试考察其生物活性,以确定是否符合组织工程对支架材料的要求。目的:观察58S生物玻璃/壳聚糖复合多孔支架的生物矿化特性及其与鼠骨髓间充质干细胞之间的体外相容性。设计、时间及地点:观察性实验,于2008-03/10在华南理工大学材料科学与工程学院生物材料研究所完成。材料:选用58S生物活性玻璃粉体为原料,利用预先处理过的聚氨酯泡沫作为模板,通过浸渍法制备58S生物玻璃支架基体,与壳聚糖复合后制成生物玻璃/壳聚糖复合支架。方法:①将试样放置于37℃恒温静态的100mL模拟生理溶液中,分别浸泡1,3,7,15d后取出样品,测试备用。②将第6代的小鼠骨髓间充质干细胞悬液以2×105/每个材料的密度接种到12孔培养板中的支架材料上复合培养。主要观察指标:采用X射线衍射分析和红外光谱分析方法对支架矿化不同时间表面生成的矿物进行分析和表征;利用扫描电子显微镜观察支架表面矿物生成情况和小鼠骨髓间充质干细胞在多孔支架材料上的生长情况。结果:①X射线衍射分析结果显示支架在模拟生理溶液中矿化7d后即出现标志羟基磷灰石形成的弱衍射峰,矿化15d后这些衍射峰变得更强,说明材料表面形成了低结晶度的羟基磷灰石。②红外光谱分析测试结果显示支架在矿化7d后即出现了标志羟基磷灰石形成的特征峰。③扫描电镜观察支架表面在矿化1d后有颗粒状的矿物生成,矿化15d后所形成的矿物成绒毛状,几乎覆盖整个支架表面。④小鼠骨髓间充质干细胞在支架材料上培养5d后黏附生长良好,进一步表明此支架材料具有较高的生物矿化特性和细胞相容性。结论:制备的58S/壳聚糖复合生物玻璃多孔支架具有较高的生物活性、与鼠骨髓间充质干细胞相容性良好。

PBS/壳聚糖复合材料表面选择性激光刻蚀PBS的研究

为了改善聚丁二酸丁二醇酯poly-(butylene succinate)-壳聚糖复合材料的表面生物学性能,进行193nm激光刻蚀该复合材料的研究,以提高该复合材料的表面生物活性.采用表面轮廓仪、表面水接触角分析仪、扫描电镜、红外衰减全反射研究改性后材料表面的特性;并采用DNA分析的方法分析材料表面细胞的生物学特性.研究结果表明,复合材料表面与本体的激光刻蚀能量阈值分别为59mJ/cm2和125mJ/cm2.图像定量分析表明随着刻蚀次数的增加,表面壳聚糖累计面积从0.9mm2增加到4.5mm2,达到其本体复合的比例.表面水接触角随着刻蚀次数的增加从91度减少到28度.细胞学实验表明刻蚀后表面的壳聚糖促进了成骨细胞在复合材料表面的粘附及生长.用激光表面选择性刻蚀可以提高复合材料表面生物活性的成分从而改善其生物活性.

体感诱发电位与运动诱发电位在颈椎病术中的联合应用

目的分析皮层体感诱发电位（ cortical somatosensory evoked potential, CSEP ）与经头颅电刺激肌源性运动诱发电位（ myogenic motor evoked potential, MMEP ）在颈椎病术中监护的联合应用价值。方法对35例脊髓型颈椎病患者（C3-Ce）行术中CSEP与MMEP联合监护。在不同阶段分别记录信号，与术后功能相结合，判断CSEP和MMEP的准确性。结果CSEP检出率为100％，MMEP检出率为85．7％；术中CSEP监护达报警标准1例，及时提醒医生，暂停手术操作，去除影响因素，CSEP波幅逐渐恢复；2例术中出现MMEP短暂消失；28例减压后即CSEP波幅上升；3例术前、术中、术终几乎无变化。以上病人术后均无神经症状加重。结论颈椎病患者术中联合运用csEP和MMEP监测，排除各种干扰因素后，能准确地反映脊髓生理和病理状况，提高监护效果，保障患者安全。

MDT模式下PBL教学法在老年髋部骨折临床教学中的应用研究

目的探讨多学科综合诊疗(MDT)联合以问题为基础的学习(PBL)教学法对老年髋部骨折的临床教学效果。方法选取2017年1月至2018年12月广州医科大学五年制临床医学系在广州医科大学附属第一医院骨科进行临床实习同级学生共90名,随机分为试验组(MDT模式下PBL组)45名和对照组[传统教学以讲授为基础的学习(LBL)组]45名。分别按照各组教学方式进行老年髋部骨折临床示教,比较2组的教学效果与教学满意度。结果试验组理论考试成绩较对照组高,但差异无统计学意义(P>0.05);而试验组的病例分析成绩较对照组高,同时教学满意度亦明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MDT模式下PBL教学法在老年髋部骨折临床教学中收到良好的效果,可提高学生的自学能力,值得在临床教学中进一步推广。

磷酸钙骨水泥承载药物庆大霉素的生物力学实验

目的评价承载药物庆大霉素对磷酸钙骨水泥材料生物力学性能的影响,为进一步实验和临床使用提供必要的实验依据。方法分别称取庆大霉素和磷酸钙,以不同的比例混合,充分搅拌,分成7组,每组3个样本。A组:对照组(无庆大霉素磷酸钙)、B组1∶30、C组1∶15、D组2∶15、E组1∶6、F组1∶5、G组1∶4,加入其液相溶液,固化后再分别做材料压缩实验,加载速率为0.5 mm/min,记录样本所能承受的最大压力和最大抗压强度。结果最大压缩力、最大压缩强度B^G组逐渐下降,但只有G组与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论随着庆大霉素比例的增高,磷酸钙骨水泥材料的生物力学强度逐渐下降,当庆大霉素与磷酸钙固相的质量比为1∶4进行配比时,材料的弹性模量与人体松质骨的弹性模量相当。