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MAGE-A3多克隆抗体的制备及在胃癌细胞检测中的应用 被引量:3
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作者 蔡一奇 程开 +8 位作者 陈旭东 陈孝冬 岑丹维 张婵琼 宋易玲 毛姗姗 叶晓鲜 张丽芳 朱冠保 《温州医科大学学报》 CAS 2017年第5期318-324,共7页
目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,... 目的:通过原核表达系统制备人黑色素瘤抗原A3(MAGE-A3)蛋白,制备其多克隆抗体,经鉴定后用于胃癌细胞检测。方法:将MAGE-A3全长核酸序列经原核密码子优化后全基因序列合成,克隆至原核表达载体pET21a(+),构建pET21a(+)/MAGE-A3重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达MAGE-A3蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化后的MAGE-A3蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot、免疫荧光技术分析该多克隆抗体的特异性,并用免疫组织化学技术鉴定MAGE-A3兔多克隆抗体在人胃癌细胞免疫检测应用中的可行性。结果:成功构建重组质粒pET21a(+)/MAGE-A3,并经原核表达系统表达MAGE-A3蛋白。SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量大小约为48 k Da,与预期蛋白大小一致,并以His单抗进行Western blot鉴定,出现了特异性的单一条带。MAGEA3蛋白免疫日本大耳白兔,可诱导兔产生特异性抗体,免疫后第8周达到高峰,经Western blot检测显示多克隆血清可特异性识别靶蛋白,出现阳性单一条带;经免疫荧光检测显示,在MAGE-A3阳性细胞A-375(黑色素瘤细胞株)和SGC-7901细胞(胃癌细胞株)的胞浆内出现荧光团块。表明兔多克隆抗体可特异性识别天然的MAGE-A3蛋白。结合免疫荧光结果后经ELISA检测,可认为该多克隆Ig G抗体效价可达1:40 000;免疫组织化学检测显示在A-375和SGC-7901肿瘤组织的胞浆内出现团块状棕黄色颗粒样沉淀,而在BGC-823肿瘤组织中呈阴性,表明制备的MAGE-A3兔多克隆抗体能够特异性地识别肿瘤组织中MAGE-A3蛋白。结论:通过原核表达系统制备了MAGE-A3蛋白,并免疫兔制备了MAGE-A3蛋白特异性兔多克隆抗体,同时可以特异性地识别人胃癌细胞中的MAGE-A3蛋白,可作为免疫诊断用抗原。 展开更多
关键词 人黑色素瘤抗原A3 原核表达系统 多克隆抗体 胃肿瘤
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绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 岑丹维 宋易玲 +6 位作者 张婵琼 毛珊珊 叶晓鲜 陈俊 陈韶 朱珊丽 张丽芳 《温州医科大学学报》 CAS 2017年第1期1-6,共6页
目的:通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素(PE)PE38KDEL重组蛋白,并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法:选择PE部分基因(PE38),并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL,通过原核密码子优化(http://www.jcat.de)后全基因合成,经Hind... 目的:通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素(PE)PE38KDEL重组蛋白,并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法:选择PE部分基因(PE38),并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL,通过原核密码子优化(http://www.jcat.de)后全基因合成,经Hind III和Xho I酶切位点克隆至p ET32a(+)原核表达载体,构建p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒,将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)感受态细菌中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组PE38KDEL蛋白,经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体,并采集免疫前后血清,用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果:成功构建了p ET32a(+)/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 k Da,与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示,在分子质量约57 k Da处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体,抗体效价高达1:60 000。结论:PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体,且该抗体效价高、特异性强,为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 外毒素类 PE38KDEL 多克隆抗体
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企业从业人员职业病风险的构成因素分析
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作者 吴琪琪 蔡福满 +4 位作者 冯棠棠 林佳佳 卓斐斐 范巧云 张婵琼 《中国医药指南》 2013年第20期373-374,共2页
本文分析了企业从业人员职业病风险的高温、粉尘、噪声和生产场所设计等环境因素,企业负责人和从业人员等个人因素,企业防护措施、企业自我管理和政府相关部门监督等组织管理因素,以及化学性、生物性和物理性等职业自身因素,以期为政府... 本文分析了企业从业人员职业病风险的高温、粉尘、噪声和生产场所设计等环境因素,企业负责人和从业人员等个人因素,企业防护措施、企业自我管理和政府相关部门监督等组织管理因素,以及化学性、生物性和物理性等职业自身因素,以期为政府相关部门和企业制定职业病防治策略提供依据。 展开更多
关键词 企业 职业病 风险因素
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EB病毒潜伏膜蛋白2B表位特异性兔血清抗体的制备和鉴定
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作者 张婵琼 宋易玲 +6 位作者 岑丹维 蔡一奇 叶晓鲜 毛珊珊 蒋朋飞 李文姝 张丽芳 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2016年第10期871-875,880,共6页
目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并... 目的制备EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)串联B表位特异的兔血清多克隆抗体。方法利用分子克隆技术,将已鉴定的EBV LMP2蛋白的3个B细胞表位,即RIEDPPFNSLL,TLNLT和KSLSSTEFIPN,以柔性肽(GS)加以串联连接,经原核密码子优化后全基因合成,并经BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆至pET32a(+)载体,测序鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基硫代-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。用镍螯合亲和层析柱(Ni-NTA Agarose)纯化表达产物,与佐剂乳化后皮下多点注射日本大耳白兔,隔周免疫1次,共3次。分别于免疫的0、2、4、6、8周取血,采用ELISA方法检测IgG抗体水平,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测兔血清抗体的免疫反应性和结合特异性。结果 EBV LMP2B表位重组蛋白可通过原核表达系统进行表达,纯化的表达蛋白免疫兔可产生特异性IgG抗体,效价达1∶30 000。经Western blot法和细胞免疫荧光法鉴定,制备的兔血清抗体可识别LMP2重组蛋白和LMP2天然蛋白。结论成功获得了EBV LMP2串联B表位重组蛋白,制备的兔多克隆血清抗体效价高,特异性强,为LMP2的生物学和免疫学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 EB病毒潜伏膜蛋白2 原核表达 抗体制备
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人乳头瘤病毒58型L1蛋白B细胞表位预测和分析 被引量:7
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作者 宋易玲 叶晓鲜 +4 位作者 毛珊珊 岑丹维 张婵琼 蒋朋飞 张丽芳 《中国病原生物学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第5期407-411,415,共6页
目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综... 目的对人乳头瘤病毒58型(HPV58)主要结构蛋白(L1)的B细胞表位进行预测和分析。方法利用生物信息学软件EXPASY在线分析HPV58型L1蛋白的二级结构及生物学特性,包括跨膜趋势、表面可及性、抗原性、亲水性,溶性等,从而对其B细胞表位进行综合分析和预测。结果通过亲水性参数,Zimmcrman极性,柔韧性参数,表面可及性及抗原性进行综合分析,预测人乳头瘤病毒58型L1蛋白的B细胞表位可能位于其N端的29-37,43,46-58,64-67,74,79-88,93,100-101,103-125,133-139,149,151-180,187-213,220-213,235,238-247,252-271,277-282,286-309,320-323,327-338,341-348,351,353-368,373-396,408,427,419-425,433-444,453-468,470,475-486,488-490,493-494,497-524肽段区域;进一步用Protien Plast在线同源匹配分析,79-88、190-216、373-396、453-468、497-524肽段区段为可能的B细胞表位。结论用多参数预测分析HPV58型L1蛋白可能的B细胞表位,为进一步研究高危型58型L1蛋白的生物学特性提供了理论基础。 展开更多
关键词 人乳头瘤病毒58型(HPV58) B细胞表位 L1蛋白 同源性匹配分析
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人颗粒酶B融合蛋白的原核表达及其免疫血清的制备
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作者 汪文寰 冯方方 +6 位作者 蔡一奇 张婵琼 岑丹维 宋易玲 郭刚强 张丽芳 李文姝 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2017年第3期234-238,共5页
目的在原核体系中表达人颗粒酶B(granzyme B,Gzm B)融合蛋白,并制备Gzm B免疫血清多克隆抗体。方法构建Gzm B原核表达重组质粒p ET32a-Gzm B,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组Gzm B(r Gzm B)蛋白,镍离子螯合亲和层析柱纯化表... 目的在原核体系中表达人颗粒酶B(granzyme B,Gzm B)融合蛋白,并制备Gzm B免疫血清多克隆抗体。方法构建Gzm B原核表达重组质粒p ET32a-Gzm B,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组Gzm B(r Gzm B)蛋白,镍离子螯合亲和层析柱纯化表达产物。以纯化的r Gzm B蛋白为免疫原,皮下多点注射BALB/c小鼠,共免疫3次,分别于免疫后2、4、6周经小鼠尾静脉采血,分离血清,间接ELISA法检测免疫血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平,并确定其抗体最大稀释度,免疫斑点试验检测免疫血清多克隆抗体对Gzm B的特异免疫结合特性。结果质粒p ET32aGzm B经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的r Gzm B蛋白相对分子质量为48 000;纯化的r Gzm B蛋白免疫小鼠血清中Gzm B特异性Ig G抗体水平随免疫时间延长至第4周达到高峰,随后维持一定水平;抗体最大稀释度为1∶1 600;r Gzm B免疫血清能够特异地结合Gzm B,显示了其免疫结合特性。结论制备了r Gzm B蛋白和Gzm B小鼠免疫血清多克隆抗体,为后续开展Gzm B的靶向杀伤、靶向检测等应用研究奠定了基础。 展开更多
关键词 颗粒酶B 原核表达 多克隆抗体
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