间充质干细胞联合灯盏花素基于Galectin-3/Akt/Snail通路对肾脏纤维化的影响研究

目的观察骨髓源性间充质干细胞(MSCs)和灯盏花素是否能协同抗慢性肾脏病肾脏纤维化,并探讨其可能机制。方法将50只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、灯盏花素组、MSCs组和灯盏花素+MSCs组。除正常组外,其余组大鼠采用尾静脉给予阿霉素联合腺嘌呤灌胃方法建立慢性肾脏病模型。建模结束后,灯盏花素组给予灯盏花素连续灌胃7 d;MSCs组在建模结束后第3天,尾静脉注射MSCs悬液;灯盏花素+MSCs组给予灯盏花素连续灌胃7 d,同时建模结束后第3天尾静脉注射MSCs悬液。干预结束后第3天收集尿、血检测24 h尿蛋白、血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平;取肾脏,计算肾脏指数,HE、Masson和Sirius Red染色观察肾脏组织病理变化,免疫组织化学SP法检测肾脏组织中I型胶原A1(ColIA1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达情况,Western blot法检测肾脏组织中p-Akt、Akt、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Galectin-3和Snail1蛋白表达情况。结果灯盏花素组、MSCs组和灯盏花素+MSCs组24 h尿蛋白、血清Cr和BUN水平、肾脏指数均明显低于模型组(P均<0.05)。HE、Masson和Sirius Red染色显示,模型组有肾小管腔内腺嘌呤结晶沉着,肾间质胶原纤维化明显,肾小球系膜增厚;灯盏花素组、MSCs组和灯盏花素+MSCs组肾组织病理改变明显较模型组轻,其中灯盏花素+MSCs组最轻。灯盏花素组、MSCs组和灯盏花素+MSCs组肾组织中ColIA1、p-Akt/Akt、α-SMA、Galectin-3、Snail1表达量均明显低于模型组(P均<0.05),肾组织中MMP-9表达量明显高于模型组(P均<0.05)。灯盏花素+MSCs组MMP-9表达量明显高于灯盏花素组和MSCs组(P均<0.05),灯盏花素+MSCs组p-Akt/Akt、Snail1表达量明显低于灯盏花素组和MSCs组(P均<0.05),灯盏花素组和灯盏花素+MSCs组Galectin-3表达量明显低于MSCs组(P均<0.05)。结论MSCs和灯盏花素联用较单独应用抗慢性肾脏病肾脏纤维化效果更佳,其机制可能与调节Galectin-3/Akt/Snail信号通路有关。

紫草素通过Smad3/Erbb4-IR轴对肾脏纤维化的抑制作用研究

目的研究紫草素对单侧输尿管梗阻性肾病诱导的小鼠纤维化模型的治疗作用和潜在调控机制。方法选取C57BL/6雄性小鼠30只,8周龄,体质量(20~22)g,随机分为假手术组、UUO组、紫草素低和高剂量组、厄贝沙坦组,紫草素组于术前1 h给予紫草素第1d的灌胃,连续灌胃10 d后处死小鼠,收集血清,HE和PAS观察肾脏病理,MASSON检测肾间质纤维化,IHC检测α-SMA,Western blot检测肾组织中纤维化指标和p-Smad3、Smad7的表达,RT-PCR检测TGF-β和长链非编码Erbb4-IR。结果与模型组相比,紫草素治疗后,肾功改善,病理染色显示肾小管损伤明显改善,纤维化减少;免疫印迹结果显示紫草素能够抑制TGF-β/Smad信号通路中关键蛋白Smad3活化,上调Smad7表达,而TGF-β和长链非编码Erbb4-IR的基因表达均呈现剂量依赖性下降。结论紫草素可有效减轻肾脏纤维化,其机制可能与调节Smad3/Erbb4-IR轴相关。

异甘草素通过Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴改善顺铂诱导的急性肾损伤小鼠炎症反应

目的研究异甘草素(ISO)对顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠的作用并探讨潜在调控机制。方法 30只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组(NC组),模型组(AKI组),异甘草素药物低剂量(ISO-L)和高剂量(ISO-H)处理组,厄贝沙坦阳性对照组(Irb组)。通过单次腹腔注射顺铂(20 mg/kg)建立AKI模型。在干预过程中,NC组和AKI组予以生理盐水,而ISO-L组和ISO-H组分别予以异甘草素7. 5 mg/kg、30 mg/kg,Irb组予以20 mg/kg厄贝沙坦,药物灌胃3 d后处死小鼠,收集血清检测肌酐、尿素氮,HE和PAS染色检测肾病理改变,免疫组化和免疫印迹法检测炎症关键因子(IL-6、IL-1β)和Smad3、NF-κB等关键蛋白活性,Real-time PCR检测炎症因子和长链非编码Arid2-IR改变情况。结果与AKI组比,异甘草素干预能明显改善小鼠肌酐和尿素氮(P <0. 05),且呈浓度依赖性调节;病理染色结果显示药物干预后肾炎性细胞浸润减少,肾损伤明显改善;而炎症因子、Smad3、NF-κB活性和长链非编码Arid2-IR等表达均出现显著下调(P <0. 05),表明异甘草素可以抑制Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴的活化。结论异甘草素可有效减轻AKI小鼠肾炎症反应,其机制可能与调节Smad3/Arid2-IR/NF-κB轴有关。

肾痿复方对糖尿病肾病大鼠肾组织MMP-9/TIMP-1表达的影响

目的:通过对糖尿病肾病大鼠肾功能及肾组织中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)水平的检测,探讨肾痿复方在糖尿病肾病的治疗作用。方法:40只雄性SD大鼠随机为正常对照组、糖尿病肾病组、肾痿复方低、高剂量组、每组各10只。糖尿病肾病组大鼠经高脂高糖饲料喂养2月后,腹腔注射链脲佐菌素(35mg/kg)诱导建立糖尿病肾病模型,72h后测定空腹血糖≥16.65mmol/L者视为造模成功。正常组、糖尿病肾病组大鼠予以生理盐水灌胃,低剂量治疗组、高剂量治疗组大鼠分别予以肾痿复方灌胃。给药1周后,检测24h尿蛋白、血清肌酐、尿素氮,HE和PAS染色检测肾脏病理组织改变,免疫印记法(WesternBlot)检测α-SMA、TGF-、MMP-9及TIMP-1蛋白表达。结果:①肾功:与糖尿病肾病组比较,低剂量组、高剂量组大鼠血肌酐、尿素氮水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。②肾脏形态学:HE和PAS染色显示:正常组大鼠肾小球形态结构正常,系膜细胞及基质无增生;糖尿病肾病组大鼠肾组织可见炎性细胞浸润,肾小球系膜细胞增生,基底膜增厚,肾小管上皮细胞空泡变性,管腔扩张。低、高剂量组大鼠可见肾小球、肾小管、肾间质病理损伤程度减轻,其中高剂量治疗组大鼠肾脏损害明显改善。③蛋白水平:与模型组比较,肾痿复方低、高剂量组大鼠随着药物浓度的增加肾组织中α-SMA、TGF-β1、TIMP-1表达逐渐降低(P<0.05、P<0.01或P<0.001)、而MMP-9随着药物浓度的增加表达逐渐升高(P<0.05)。结论:肾痿复方可能通过提高MMP-9,降低α-SMA、TGF-β1、TIMP-1的表达,从而减轻糖尿病肾病引起的肾脏病理损害。

肾舒胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏mTOR、beclin-1自噬通路的表达及意义

目的:研究肾舒胶囊对STZ诱导的糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的改善作用及机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、肾舒胶囊低剂量组、肾舒胶囊高剂量组、厄贝沙坦组,每组10只。除空白对照组外,余组予高脂高糖饲料喂养2个月后,连续5天腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg)诱导建立DN模型。空白对照组、模型组大鼠予以生理盐水灌胃,肾舒胶囊低、高剂量组大鼠予以肾舒胶囊溶液灌胃,厄贝沙坦组大鼠予以厄贝沙坦溶液灌胃。1周后,检测各组小鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)指标,采用HE和PAS染色检测肾脏病理组织改变,以Western Blot检测p-mTOR、beclin-1蛋白含量,以Realtime-PCR检测beclin-1 mRNA表达水平。结果:(1)肾功能指标:与空白对照组比较,模型组大鼠Scr、BUN明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,肾舒胶囊低、高剂量组和厄贝沙坦组大鼠Scr、BUN水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);与厄贝沙坦组比较,肾舒胶囊低剂量组与高剂量组Scr、BUN有所下降,但差异无统计学意义;与肾舒胶囊低剂量组比较,肾舒胶囊高剂量组大鼠Scr、BUN降低,差异无统计学意义。(2)肾脏形态学:HE和PAS染色结果显示,空白对照组大鼠肾小球、肾小管和肾间质形态结构无异常改变;模型组大鼠肾组织可见炎性细胞浸润,肾小球系膜细胞增生,基底膜增厚,肾小管上皮细胞空泡变性,管腔扩张。肾舒胶囊低、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠可见肾小球、肾小管、肾间质病理损伤程度减轻,其中肾舒胶囊高剂量组大鼠肾脏损害明显改善。(3)自噬通路因子:与空白对照组比较,模型组p-mTOR、beclin-1蛋白表达水平和beclin-1 mRNA表达水平均显著增高(P<0.05或P<0.01);与模型组比较,肾舒胶囊低、高剂量组及厄贝沙坦组大鼠肾组织p-mTOR、beclin-1蛋白表达水平和beclin-1 mRNA表达水平均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)。结论:肾舒胶囊能明显改善糖尿病大鼠早期肾脏损害,其机制可能与抑制肾组织mTOR、beclin-1的表达水平有关。

利用HRM技术鉴定db/db小鼠基因型方法的建立

目的:利用高分辨率熔解曲线(high resolution mmelting,HRM)技术,建立一种快速鉴定db/db小鼠基因型的方法。方法:以鼠尾组织为实验材料,采用改良法提取小鼠基因组DNA;在突变位点的上游和下游设计引物,用PCR-HRM法区分db/db子代小鼠三种基因型,并通过对反应条件的不断优化(扩增反应温度、体系等),建立成熟稳定的HRM分型方法,进一步通过DNA测序法对分型结果的准确性进行验证。结果:优化后的HRM法能够准确地分辨出三种基因型,分型结果与DNA测序法结果高度一致,且分型结果与小鼠表型所体现出来的疾病状态一致,说明HRM法准确度高,稳定性好。结论:建立的PCR-HRM分型方法是一种快速、简便、准确度高的技术,适用于大批量db/db子代小鼠基因型的检测。