产蛋初期和后期蛋鸡胫骨转录谱的构建及骨代谢相关基因分析

旨在通过分析产蛋初期和产蛋后期蛋鸡胫骨转录表达谱筛选与胫骨骨代谢相关的候选基因,以揭示蛋鸡骨代谢变化的遗传机制。本研究选择19周龄(产蛋初期)和79周龄(产蛋后期)的海兰灰蛋鸡各3只,构建胫骨转录组文库,利用转录组数据筛选差异表达基因并预测蛋白质互作关系;随机选择5个差异表达基因,利用实时荧光定量PCR验证其表达水平。构建的6个海兰灰蛋鸡胫骨cDNA文库中获得有效读数19034718~22668315条,Q30值至少为93.68%,比对率为83.78%~85.72%。筛选出产蛋初期和产蛋后期蛋鸡胫骨差异表达基因共1211个,其中645个基因下调,566个基因上调。GO功能富集分析结果显示,差异表达基因主要富集在细胞分化和细胞发育等过程。KEGG分析发现,差异表达基因显著富集在11条通路(P<0.05),其中5条与骨代谢相关,包括MAPK信号通路、TGF-β信号通路、Toll样受体信号通路、糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/硫酸皮肤素和糖胺聚糖降解。在上述5条通路中涉及59个差异表达基因,其中29个上调,30个下调。此外,对骨代谢相关通路中的59个差异表达基因进行蛋白互作分析,共鉴定出53个编码蛋白,筛选出5个hub基因(IL6、IL1B、FOS、TGFB2和BMP4)。从1211个差异表达基因中随机选取5个差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,结果与转录组测序结果一致。本研究揭示了产蛋初期和产蛋后期蛋鸡胫骨组织中的基因表达差异,筛选到多个影响蛋鸡胫骨骨代谢的差异表达基因和信号通路,为研究调控蛋鸡胫骨组织骨代谢的分子机制提供理论依据。

绵羊miR-200b启动子鉴定及其对卵泡颗粒细胞线粒体功能的影响

旨在鉴定绵羊miR-200b的启动子区并研究其对卵泡颗粒细胞线粒体功能的影响。本研究体外分离培养绵羊卵泡颗粒细胞,通过构建包含3个不同长度启动子区重组质粒,利用生物信息软件和双荧光素酶报告试验预测并鉴定绵羊miR-200b核心启动子区;利用在线工具预测转录因子NR4A1的结合位点;通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR检测过表达NR 4A1基因对miR-200b启动子活性和表达水平的影响;通过转染miR-200b mimic和mimic NC,分别检测颗粒细胞线粒体形态和数量、线粒体膜电位、ROS水平、ATP和线粒体呼吸链复合物Ⅰ的浓度,并检测线粒体氧化磷酸化相关基因表达水平。结果表明,miR-200b-P1(-159/+36 nt)活性最高,确定该区域为miR-200b核心启动子区;预测出核心启动子存在1个NR4A1的结合位点,且过表达NR 4A1基因显著上调miR-200b启动子活性和miR-200b的表达水平(P<0.01)。与mimic NC组相比,转染miR-200b mimic导致颗粒细胞平均光密度显著降低(P<0.01),细胞长度显著缩短(P<0.01)、线粒体膜电位下降(P<0.05)、ATP(P<0.05)和线粒体呼吸链体复合物Ⅰ(P<0.01)的浓度降低、ROS水平升高(P<0.01),同时下调ATP 6V1G1和NDUFV 1的表达(P<0.01),上调NOX 4的表达水平(P<0.01)。该研究确定了绵羊miR-200b的核心启动子区(-159/+36 nt),NR4A1正向调控miR-200b的转录,且miR-200b能够影响线粒体氧化磷酸化过程,诱导颗粒细胞线粒体损伤。该研究结果为进一步揭示miR-200b调控绵羊卵泡发育的机制提供了理论依据。

鸡zp1基因对成骨细胞矿化的影响

本研究旨在克隆编码鸡透明带1(zona pellucida 1,Zp1)蛋白的zp1基因,并研究其组织表达谱及在成骨细胞矿化中的作用。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测蛋鸡不同组织和性成熟启动前后胫骨中的zp1表达水平;将Zp1过表达载体转染至诱导分化8 d的鸡颅骨成骨细胞内,检测细胞外矿化基质和矿化相关基因表达。结果表明,鸡zp1基因全长3045 bp,编码958个氨基酸残基,具有2个N-糖基化位点。zp1基因在产蛋期鸡肝脏中高水平表达,其次为胫骨和卵黄膜,在蛋壳腺和心脏中不表达。鸡性成熟启动后血浆雌激素(estrogen,E2)、胫骨糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量和zp1表达量均极显著高于性成熟启动前。在过表达Zp1的鸡成骨细胞中添加雌激素后,细胞外矿化基质和矿化相关基因表达水平均显著升高。因此,zp1基因表达具有组织特异性,在雌激素作用下正向调控鸡成骨细胞矿化,为阐明Zp1在鸡产蛋期骨骼中的功能特性奠定了理论基础。