肾素血管紧张素系统在溃疡性结肠炎小鼠肠-血屏障损伤中的调控作用

本研究旨在探讨肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在溃疡性结肠炎小鼠肠-血屏障损伤中发挥的作用。选取16只ICR小鼠,随机分为正常对照组(Control组)和葡聚糖硫酸钠盐处理组(DSS组),等体积灌胃生理盐水。试验至第4天,DSS组小鼠在饮用水中添加DSS(终浓度为4%)制造小鼠溃疡性结肠炎模型。期间每天记录小鼠体重、粪便性状和粪便隐血情况,并计算疾病活跃指数(disease activity index, DAI)。DSS饮用至第8天,所有小鼠采血后剖检,量取结肠长度,取结肠组织等样品。进行如下试验:1)HE染色观察结肠组织病理变化;2)ELISA法检测血液中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGFA)及结肠组织中Ang1-7和AngⅡ的含量;3)Western blot检测结肠组织中血管紧张素转化酶2(angiotensin-coverting enzyme 2, ACE2)、血管紧张素转化酶(ACE)和质膜膜泡关联蛋白(plasmalemma vesicle associated protein, PLVAP)的表达;4)斯皮尔曼相关性分析ACE2、ACE与PLVAP表达变化的相关性以及Ang1-7、AngⅡ和VEGFA含量变化的相关性。结果显示:1)成功建立了DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型,小鼠表现为体重下降、DAI极显著升高(P<0.01)、结肠极显著缩短(P<0.01)和结肠组织出现明显的病理变化;2)与对照组相比,DSS组小鼠表现肛门明显出血,结肠组织中PLVAP和VEGFA蛋白表达均极显著升高(P<0.01);3)与对照组相比,DSS组小鼠结肠组织中ACE2和ACE表达均极显著上调(P<0.01),Ang1-7和AngⅡ含量分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)升高;4)相关性分析显示,ACE2、ACE的表达变化和PLVAP表达变化呈正相关,Ang1-7、AngⅡ含量变化与VEGFA含量变化也呈正相关。以上结果表明,DSS致小鼠结肠炎症过程中小鼠结肠血管屏障受损,结肠局部RAS均处于激活状态,ACE/AngⅡ通路的激活占优势,提示:AngⅡ参与了结肠炎小鼠肠-血屏障的损伤过程。通过激活ACE2或过表达ACE2,增强其对AngⅡ的降解作用以缓解肠-血屏障的损伤,可能是治疗或缓解溃疡性结肠炎的一个新的思路或途径。

临床腹泻猪空肠组织中肾素-血管紧张素系统(RAS)的表达变化及与肠道炎症的关系

在现代生猪规模化养殖过程中,无论是断奶、换舍和换料等因素引起的应激反应还是细菌、病毒感染都极易影响消化道健康引起以腹泻为主要症状的肠道炎症。本文通过研究临床腹泻猪空肠组织中肾素-血管紧张素系统(renin-angiobensin system,RAS)的表达变化,探讨其与肠道炎症的关系。以临床上出现腹泻症状的保育猪为研究对象,截取其空肠组织,采用组织病理学、Western blot和RT-qPCR等方法,观察其空肠组织病理变化,明确RAS组分特别是血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)的表达变化,探究其对猪肠道炎症损伤的影响。结果表明,临床腹泻保育猪的空肠组织中促炎性因子TNF-α、IL-1β显著升高,抗炎性因子IL-10无明显变化;组织病理学显示,空肠上皮绒毛脱落,腺体增生,存在大量出血点;ACE2、MasR mRNA和蛋白水平及Ang(1-7)含量均降低,ACE和AT1R蛋白水平及Ang II含量均升高。结果提示,临床腹泻保育猪空肠组织局部RAS被激活,ACE-Ang II-AT1R轴的活性远高于ACE2-Ang(1-7)-MasR轴,ACE2抗炎性损伤作用处于劣势。

二脒那秦通过内源性激活ACE2抑制AngⅡ-TGF-β1通路缓解小鼠肺纤维化

本试验通过博来霉素诱导建立小鼠肺纤维化损伤模型,探究二脒那秦(diminazene aceturate,DIZE)内源性激活血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)对小鼠肺纤维化发生发展的缓解作用。将24只雄性ICR小鼠随机均分为对照组(CON组)、模型组(MOD组)和二脒那秦处理组(DIZE组)。除CON组外,其余2组小鼠一次性气管内注射博来霉素(5 mg·kg^(-1))建立肺纤维化损伤模型。造模1 d后,DIZE组小鼠给予DIZE[15 mg·(kg·d)^(-1)]灌胃处理,CON组和MOD组小鼠同等剂量灌胃生理盐水。连续灌胃28 d,采血后,处死所有小鼠,取肺组织,进行如下试验:(1)肺组织称重,计算小鼠肺系数;HE和Masson染色观察肺病理组织学变化;碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸的含量;(2)间接ELISA法检测血清中AngⅡ和Ang 1-7含量;(3)RT-qPCR及Western blot法检测肺组织中纤维化相关因子基因和蛋白等的表达水平。结果表明:(1)与CON组相比,MOD组小鼠肺系数及羟脯氨酸含量极显著或显著升高(P<0.01&P<0.05);肺组织出现明显病理变化,主要表现肺泡塌陷,炎性细胞浸润,肺泡间隔充血、增厚,有大量胶原纤维沉积。经DIZE处理后肺系数及羟脯氨酸含量显著或极显著降低(P<0.05&P<0.01);肺纤维化程度明显减轻;(2)与CON组相比,MOD组小鼠肺组织中ACE2蛋白表达下调,血清中AngⅡ含量极显著升高(P<0.01),Ang 1-7含量极显著降低(P<0.01);DIZE处理逆转了以上变化;(3)与CON组相比,MOD组小鼠肺组织中Col1a1和Col3a1基因表达极显著上调(P<0.01),α-SMA及TGF-β1基因和蛋白表达均极显著上调(P<0.01),上皮细胞的特征蛋白E-cadherin蛋白表达极显著下调(P<0.01);与MOD组相比,DIZE组缓解了以上变化。一次性气管内注射博来霉素,28 d后可成功诱导小鼠肺纤维化损伤,高水平的AngⅡ可能协同TGF-β1参与了小鼠的肺纤维化;DIZE可能通过内源性激活ACE2,降低AngⅡ的高水平,对小鼠的肺纤维化具有一定的缓解作用。

植物雌激素大豆黄酮对牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

本试验采用大豆黄酮(DZ)作用于牛乳腺上皮MAC-T细胞,探讨其通过上调雌激素受体β(ERβ)表达对细胞体外增殖及细胞周期的影响,为DZ改善乳腺发育提供依据。采用不同浓度DZ(0~160.0μmol/L)处理MAC-T细胞24 h,通过检测细胞活力确定DZ作用浓度;然后采用不同浓度DZ(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)处理MAC-T细胞12、24、36和48 h,通过检测细胞活力确定DZ作用时间;再用生理剂量的雌二醇(E2)作为阳性对照,对各处理细胞进行细胞计数,采用Western blot分析细胞内细胞周期相关蛋白、ERβ蛋白相对表达量,并用流式细胞技术分析细胞周期变化。结果表明:1)与对照组相比,2.5和5.0μmol/L DZ处理细胞均能提高MAC-T细胞活力,其中5.0μmol/L DZ处理显著提高细胞活力(P<0.05);而在浓度高于10.0μmol/L后,细胞活力均有下降,因此确定了DZ作用的低、中和高浓度分别为2.5、5.0和10.0μmol/L;而与对照组相比,处理12 h后,5.0μmol/L DZ处理使得细胞活力显著提高(P<0.05),其他2个浓度处理对细胞活力无显著影响(P>0.05),因此确认DZ作用时间为12 h。2)与对照组相比,5.0μmol/L DZ处理使得细胞数量显著增加(P<0.05);2.5μmol/L DZ处理使得细胞数量有所增加,但差异不显著(P>0.05);E2处理使得细胞数量略低于各DZ处理,但差异不显著(P>0.05)。3)Western blot结果显示,与对照组相比,3个浓度DZ处理均可上调增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、细胞周期蛋白D3(CyclinD3)和ERβ的蛋白相对表达量,其中5.0μmol/L DZ处理显著上调PCNA、CyclinD1和ERβ的蛋白相对表达量(P<0.05)。4)与对照组相比,5.0μmol/L DZ处理极显著提高了G2-M期细胞占比(P<0.01),同时极显著提高了S期细胞占比(P<0.01);E2处理与5.0μmol/L DZ处理趋势相同,均极显著提高了G2-M期细胞占比(P<0.01),同时提高了S期细胞占比(P>0.05)。结果提示,植物雌激素DZ具有类雌激素样作用,可通过上调ERβ蛋白表达,提高G2-M细胞占比,阻滞细胞周期在S期,从而促进乳腺细胞的增殖。

硫酸化银杏叶多糖的制备及对犬细小病毒疫苗免疫增强作用的研究

本研究通过水提醇沉淀法从银杏叶干粉中提取粗多糖,经脱色素、除蛋白等处理得到精制银杏叶多糖,利用氯磺酸—吡啶法制得硫酸化银杏叶多糖,其多糖含量为68.6%,蛋白含量为2.59%,硫酸基含量为16.4%,硫酸基取代度为1.74;通过犬的体内免疫实验,研究硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗免疫反应的影响。结果表明,硫酸化银杏叶多糖能够不同程度的提高免疫后血清CPV抗体水平和IL-2的含量。由此表明,硫酸化银杏叶多糖对犬细小病毒活疫苗具有免疫协同作用,这为硫酸化银杏叶多糖作为免疫增强剂的开发奠定了试验基础。

中国家鹅血管紧张素转化酶2(ACE2)基因的克隆、表达及序列解析

通过对中国家鹅血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因进行克隆、表达、序列信息分析以及对中国家鹅SARS-CoV-2易感性进行分析,旨在为鹅ACE2方面的研究提供基础资料。以中国家鹅为研究对象,检测其不同组织的ACE2基因表达,并扩增出肾组织的ACE2全基因编码区序列。将ACE2目的基因与pMD-19T重组后导入DH5α感受态细胞,随机挑取单菌落进行菌液PCR和酶切验证,并对验证为阳性的单菌落进行测序。对测序所得序列进行生物信息学分析,同时对鹅与人及其他动物ACE2结合SARS-CoV-2的氨基酸序列进行了差异性比较。结果显示,鹅体内有ACE2表达,并在肾脏中有较高的表达水平;扩增出该鹅的ACE2基因ORF序列长度为2473 bp,编码808个氨基酸,氨基酸序列与中国麻鸭的同源性最高,且处在同一进化分支中;进一步对ACE2编码蛋白质分析显示,该中国家鹅ACE2蛋白有较高亲水性,为Ⅰ型跨膜蛋白,信号肽位于第1~17氨基酸之间;此外,对鹅与人及其他动物ACE2的SARS-CoV-2结合关键氨基酸序列的比较显示,鹅与人等对SARS-CoV-2易感性较高动物的该序列差异较大,而与鸡、鸭等禽类较接近,提示鹅对SARS-CoV-2无易感性。研究获得了鹅ACE2基因与蛋白的相关资料,为鹅ACE2相关研究提供了基础理论依据和资料。