玉米秸秆辅料发酵猪尸体生态系统微生物多样性的变化研究

该研究为揭示玉米秸秆发酵辅料对猪尸体生物发酵池中微生物多样性的变化。实验建立生物发酵池,并从中采样5次,每次采样4个位置共20组。采用16S rDNA测序技术对稳定运行的发酵池内微生物多样性和结构组成进行研究,建立进化树和多样性分析讨论。不同的优势菌群影响着发酵的进程,厚壁菌门(芽孢八叠球菌属、微小杆菌属)、变形菌门(拟产碱菌属)细菌为3种发酵优势菌群。

黔西南泥堡特大型金矿床的新发现及其控矿因素

为了在黔西南泥堡金矿区获得找矿突破,进一步厘清矿床控矿因素,近年来,贵州省地质矿产勘查开发局一〇五地质大队根据其积累的黔西南地区金矿找矿经验建立了区域成矿模式,结合该区地表已知金矿体赋存特征,通过对以往大量地质资料再研究,并通过大量深部钻探工程验证,获得了一些新发现:二龙抢宝背斜是一次级褶皱,为隐伏的F1断层上盘的牵引褶皱;新发现了F1断层破碎蚀变带中的厚大金矿体,单矿体达大型矿床规模,从而使泥堡金矿达特大型矿床规模,并新发现了深部泥堡背斜核部的层控型矿体;在黔西南地区,首次在泥堡金矿区中二叠统茅口组中的断层破碎带内发现了金矿体。进一步研究得出泥堡金矿床的控矿因素是:1地层,泥堡金矿体主要产于中二叠统茅口组,上二叠统龙潭组一段、二段和三段;2构造,泥堡金矿体产于泥堡背斜南翼,主要受F1逆断层控制,其次受二龙抢宝背斜核部附近的构造蚀变体控制;3岩性,当岩石为角砾岩或砾屑砂岩、沉凝灰岩、不纯碳酸盐岩时有利于成矿,特别是岩层厚度较薄,成分复杂,孔隙多,其顶、底板为透水性差的黏土岩、粉砂质黏土岩时易富集形成金矿(化)体。

云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素基因分子结构特征分析

目的分析2003-2008年云南边境禽流感H5N1亚型病毒血凝素(HA)基因分子结构特征。方法对2003-2008年在云南边境采集境外禽类样品420份,做H5/N1亚型特异性RT-PCR及多重RT-PCR检测,对阳性样品中H5N1病毒HA基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及系统发育分析。结果21份代表性病毒样品HA裂解位点序列存在4种不同排列方式,均具有高致病性禽流感病毒分子结构特征;HA受体结合位点、糖基化位点及表位关键性氨基酸位点存在变异;系统发育分析表明可划分为5个不同进化分枝(1、2.4、2.3.2、2.3.4、7)。结论2003-2008年云南边境外H5N1病毒间具有遗传差异,进化分枝2.3.4毒株为当地流行的优势毒株,不同进化分枝或同一进化分枝不同毒株HA基因存在变异。

云南省2006-2010年狂犬病病毒N和G基因分子结构特征分析

目的了解云南省狂犬病毒的流行情况以及街毒株N、G基因结构特征,为有效控制狂犬病疫情提供初步科学依据。方法对云南省2006-2010年10株狂犬病街毒株N、G基因进行全基因克隆、测序,并与已知国内外代表毒株核苷酸及推导氨基酸进行序列比对及系统发育分析。结果序列分析表明所研究的10个云南毒株与Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型代表毒株N、G基因核苷酸序列同源性分别为72.1%～78.5%、58.4%～71.0%,与基因Ⅰ型毒株序列同源性为85.2%～90.1%、82.7～99.6%,云南毒株之间核苷酸序列同源性为89.3%～99.2%、86.0～99.6%。云南10个毒株均为基因Ⅰ型和血清1型毒株,分为2个进化分支,除YNTC06与GXN119和HM88单独属于分支Ⅲ外,其余云南毒株均分布在分支Ⅰ上,且进一步分为3个小亚分支。遗传进化分析表明,各毒株氨基酸位点均存在不同程度的变异,其中YNTC06在360、369、375等多个NP抗原位点存在变异;云南毒株在GP330、333位毒力决定位点未发生变异,均为强毒株。结论云南狂犬病毒属于基因Ⅰ型,存在2个分支;云南狂犬病毒NP和GP存在特异性氨基酸变异位点,其基因结构及变异、亚组群划分与地理位置无相关性。

2011—2016年云南新城疫病毒感染状况调查

为了解云南地区新城疫流行现状,于2011—2016年在云南部分地区开展了基于风险的新城疫流行病学调查。调查范围涉及昆明、玉溪、大理、丽江、普洱和曲靖六市共48个采样点,共采集不同种类家禽棉拭子样品2 565份。结果显示:共分离到新城疫病毒52株,来源于17个活禽交易市场,新城疫病毒个体阳性率为2.03%,场点阳性率为35.41%。52株新城疫病毒中17株为强毒株,来源于7个农贸市场,新城疫强毒株个体阳性率为0.66%,强毒株场点阳性率为14.58%。遗传演化分析表明:52株新城疫病毒可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,其中ClassⅠ17株,均属于基因3型;ClassⅡ共35株,可分为4种基因型,其中基因Ⅰ型2株,Ⅱ型16株,Ⅵ型13株,Ⅶ型4株。分析表明近年来云南地区流行的新城疫病毒具有多样性,其中基因Ⅵ型主要在鸽群流行,而Ⅶb和Ⅶh亚型则主要在鸡和鹅群中流行。值得关注的是在云南地区首次分离到2株Ⅶh新城疫病毒,而这种基因Ⅶh型的病毒一直在越南等东南亚地区呈地方流行。因此,在该地区应该进一步加强主动监测,分析这种新传入基因型新城疫病毒的分布,防止病原进一步扩散。

禽流感病毒M1蛋白型特异性表位分析

目的对流感病毒基质蛋白1(M1)型特异性表位进行定位研究。方法采用针对禽流感病毒M1蛋白的型特异性单克隆抗体,淘选M13噬菌体展示的12肽随机肽库,进行M1蛋白表(拟)位分析。采用ELISA、竞争性ELISA、免疫印迹分析不同噬菌体拟位与单克隆抗体的免疫反应性。结果筛选获得共有序列NxPHLR,定位于M1蛋白222-224位(HPN)、229-230位(LR)氨基酸区域。含有NxPHLR基序的噬菌体拟位能与单克隆抗体发生特异性结合,且此结合能被天然病毒抗原抑制或阻断,表明拟位多肽真实模拟了天然病毒蛋白与单克隆抗体结合的抗原决定簇或表位。结论M1蛋白222-230位氨基酸(HPNSSARLR)序列构成了流感病毒型特异性表位。

2013年云南省禽流感病毒H9N2亚型监测及其血凝素基因序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒（AⅣ）的变异情况,本研究对2013年云南省16个地区的3 622份家禽临床样品进行AⅣ的鸡胚分离和RT-PCR检测,其中分离鉴定到97份H9N2亚型AⅣ分离株,并选取21个分离株进行HA基因测序及系统进化分析,结果表明：21份H9N2亚型AⅣ分离株的HA基因核苷酸序列同源性为86.0 ％～99.4％,均属于欧亚分支的类A/Chicken/BeiJing/1/1994亚分支,而且又进一步划分为Ⅲ-1、Ⅲ-2两个小分支.其中Ⅲ-2分支为云南地区新出现的进化分支.氨基酸比对分析显示,测序的21个HA基因编码蛋白的裂解位点基序均具有低致病性病毒分子特征;与现用疫苗株相比,HA推导氨基酸序列中存在多个氨基酸位点差异;其中,Ⅲ-1与Ⅲ-2分支的AⅣ的HA氨基酸序列多个位点存在各自特有的点突变（氨基酸替换）,这种变异具有一定的进化（亚）分支特异性.此外,HA基因多个受体结合位点氨基酸存在变异,其中234位氨基酸全部变为L,呈现了人流感受体结合特性;部分糖基化位点、抗原表位关键性氨基酸也存在变异.

云南省禽流感、新城疫与3种免疫抑制性病原共感染的检测

为调查云南省禽流感病毒、新城疫病毒与免疫抑制性病毒混合感染的情况,对云南省2007年1月～2009年10月期间145份禽流感阳性及30份新城疫阳性样品进行禽网状内皮增生病病毒(REV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及鸡传染性贫血病毒(CIAV)的检测。禽流感阳性样品中ALV-J的感染阳性率为15.9%,REV的感染阳性率为22.8%,CIAV的感染阳性率为26.9%;新城疫阳性样品中ALV-J的感染阳性率为13.3%,REV的感染阳性率为23.3%,CIAV的感染阳性率为26.7%;共有30份样品发生多重感染,多重感染率为17.1%。对不同区域的4份禽白血病病毒阳性样品、10份禽网状内皮增生病病毒阳性样品、10份禽传染性贫血病毒阳性样品进行了序列比对和系统发育分析。结果表明,云南ALV-J毒株gp85基因与国内外毒株核苷酸及氨基酸同源性分别介于80.4%～96.7%、85.2%～94.5%;REV毒株env基因核苷酸及氨基酸之间的同源性为98.8%～99.8%、97.7%～99.5%;CIAV毒株vp2基因核苷酸及氨基酸之间的同源性为92.4%～100.0%、93.7%～100.0%。

新城疫病毒云南分离株F基因变异特性分析

采用RT-PCR技术对云南2007年-2009年采集的948份喉气管拭子或组织样品中新城疫病毒F基因进行检测,获得阳性样品65份,选择30份代表性阳性样品采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明,新城疫病毒云南分离株F基因核苷酸与疫苗LaSota株之间的同源性为70.5%～99.8%,与F48E9株之间的同源性为70.7%～90.8%。系统发育分析表明,30株病毒中21株属于基因型Ⅶ,裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F,与传统认为强毒裂解位点氨基酸序列相同;7株属于基因型Ⅱ,5株裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R-L,属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征,2株裂解位点氨基酸为R-R-Q-K-R-F属于强毒裂解位点氨基酸序列;2株病毒与9个基因型的同源性差异较远。

云南高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR技术对云南2007年采集的48份猪组织样品中病毒Nsp2基因进行检测,获得阳性样品14份,选择5份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比较及系统发育分析。结果发现云南病毒样品Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为95.8%～99.0%和92.3%～98.6%。5份样品病毒Nsp2蛋白482位、534位～562位氨基酸均存在缺失,其中1份样品(YNMG)486位～489位氨基酸也发生了缺失。云南病毒样品在系统发育树上可划分为4个亚组群,分别与广东、广西、贵州、浙江、江苏、山东毒株遗传关系密切。

云南地区马流感病毒检测及其HA基因序列分析

马流感能引起马属动物的高度接触性呼吸道传染病。该病毒已知仅存在H7N7（马流感病毒1型）、H3N8（马流感病毒2型）两个亚型，目前仅H3N8亚型毒株在全球范围内引起马流感流行和暴发。采用A型及H3亚型特异性RT-PCR技术，检测云南疑似马流感病例鼻腔棉拭子样品；HA基因PCR扩增产物经纯化后，克隆至pMD18-T载体进行测序，并与已知代表性毒株对应序列进行比对及系统发育分析。研究发现云南马流感病毒与已知代表毒株血凝素基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别介于91．2％-99．2％和89．5％-98．4％，属于美洲谱系（American lineage）佛罗里达亚谱系（Florida sub-lineage）毒株。

犬附红细胞体病研究现状

附红细胞体病简称附红体病,是由附红细胞体寄生于红细胞表面、血浆及骨髓所引起的人畜共患传染性疾病。附红细胞体感染犬后常呈亚临床性表现,当犬机体免疫能力下降便可引起该病发生。患犬表现高热、黄疸、溶血性贫血为主要症状,病死率可高达80%,严重危及犬的生命健康。随着临床病例增多而呈暴发趋势流行,附红细胞体病已引起了临床兽医工作者的广泛关注。文章对该病的病原学、流行特点、致病机理、临床表现、实验室检查以及治疗进行了综述,为犬附红细胞体病的研究和治疗提供资料。

云南边境Asia1型口蹄疫监测及病毒vp1基因序列比较

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵袭偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病。口蹄疫病毒存在7个不同血清型,病毒VP1蛋白抗原性差异是病毒血清型划分依据,而其编码基因核苷酸序列差异是同型病毒Topotype型或基因型划分依据。采用RT-PCR及O/A/C/Asia1多重RT-PCR技术,对2006年期间自云南边境地区采集境外流动动物组织样品120份,进行口蹄疫病原监测,检出Asia1型口蹄疫病毒阳性样品7份。对阳性样品中病毒vp1基因全序列进行扩增、纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比对及系统发育分析。结果发现:云南边境Aisa1型口蹄疫病毒阳性样品vp1基因核苷酸序列同源性介于83.4%～99.5%,不同分离毒株以15%序列差异作为分型标准,存在1个新拓朴型或基因型Ⅴ,且与已知的4个拓朴型或基因型不同。系统发育分析确定了1个新的遗传谱系Ⅶ。部分VP1蛋白表位关键性氨基酸位点存在变异。

2012年-2013年云南边境禽流感病毒 H5N1亚型血凝素基因分析

为了解2012年-2013年云南边境禽流感病毒 H5N1亚型血凝素（HA）基因变异及进化特征，在云南边境采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品1500份，经禽流感病毒 H5N1亚型特异性多重 RT-PCR 检测，选择代表性阳性样品，进行病毒 HA 基因扩增、纯化、克隆和测序，并与已知毒株和参考毒株序列进行序列比对及系统遗传进化分析。结果自1500份样品中检出 H5N1亚型阳性样品60份，60份阳性样品病毒 HA基因测序获得23种 HA 序列，可划分为2个不同进化分支（2．3．2，2．3．4），2．3．2进一步可划分为3个进化小分支（Ⅱ-1～Ⅱ-3），在23份代表性阳性样品中，17份样品属于进化小分支2．3．2Ⅱ-1，3份属于2．3．2Ⅱ-2，其余3份属于2．3．4；阳性样品中病毒 HA 裂解位点序列均具有高致病性禽流感病毒分子结构特征，HA受体结合位点、糖基化位点、表位关键性氨基酸位点及其他氨基酸位点存在变异，部分位点的变异具有分支或亚（小）分支特异性。2012年-2013年期间云南边境禽流感病毒 H5N1亚型间具有遗传差异，进化分支2．3．2Ⅱ-1成为当地流行的优势毒株。

2014年云南地区禽流感H5N1亚型病毒全基因进化及分子结构特征分析

2014年3月云南地区发生H5N1亚型禽流感疫情。为了解引起该疫情的病毒全基因变异特征及遗传进化关系，我们在云南通海、安宁、大理采集死亡鸡喉气管40份，经H5N1亚型禽流感病毒（AIV）特异性多重RT-PCR检测。从检测结果呈阳性的26份样品中每个地区挑选2份病毒阳性样品进行全基因测序分析，结果显示6株AIVs均属于2．3．4．4进化小分支。同一病毒株不同基因节段呈现不同进化关系。蛋白序列的变化主要为：HA的受体结合位点和表位关键性氨基酸位点存在变异，新增加2个糖基化位点；NA缺失4个糖基化位点；PB2的aa627为谷氨酸（E）；NS在aa80-aa84发生缺失；PB1、PA、NP、M关键性氨基酸位点均存在部分替代或突变。本研究测序的6个H5N1亚型AIVs与之前的AIVs间具有遗传差异，这种进化小分支2．3．4．4的AIVs已成为当地流行的优势病毒株。

2009年-2014年云南边境禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶基因进化分析

为了解云南边境禽流感病毒H5N1亚型神经氨酸酶(NA)基因变异及进化特征,2009年-2014年期间在云南边境采集境外家禽和野生鸟类棉拭子样品1 500份,经禽流感H5/N1亚型病毒特异性多重RT-PCR检测,对阳性样品进行病毒NA基因扩增、纯化、克隆和测序,并与已知毒株和参考毒株进行序列比对及系统进化分析。结果从1 500份样品中检出禽流感病毒H5N1亚型阳性样品60份;60阳性样品病毒HA基因测序获得21种NA序列,可划分为4个不同进化分支。NA基因与HA基因呈现不同进化关系;云南边境毒株NA aa275位点未发生变异,因此变异毒株对神经氨酸酶抑制剂Oseltamivir(达菲)类抗病毒药物可能无抗性或耐药性;2009年-2014年期间云南边境H5N1亚型病毒NA间具有遗传差异,NA基因进化分支4已成为当地流行的优势毒株。

Mx1基因在云南地方鸡种肝脏中的表达分析

禽类是禽流感的自然宿主,对禽类Mx1基因进行研究具有重要意义。研究以生活环境和饲养条件均一致的28、49、70、91和112日龄的6个云南特色鸡种大围山微型鸡(DWS)、武定鸡(WD)、茶花鸡(CH)、无量山乌骨鸡(WLS)、盐津乌骨鸡(YJ)、瓢鸡(PC)各12只作为试验动物,采用RT-q PCR(实时荧光定量PCR)的方法检测试验鸡品种的Mx1基因在肝脏中的表达图谱,并对同日龄不同鸡品种及不同日龄相同鸡品种Mx1蛋白基因表达差异进行分析。结果:同一日龄不同鸡种间Mx1表达差异较大,特别是DWS品种鸡于70日龄前的Mx1基因表达量均高于其他五种品种鸡;同一品种不同日龄Mx1基因表达量也有一定的差异,特别是同一鸡种在28、70日龄时Mx1基因表达量高于其他时段。研究结果为进一步研究鸡Mx1基因的抗病机理与抗病育种应用奠定了基础。

牛奇异变形杆菌的分离鉴定及16SrRNA基因系统发育分析

目的:对发病断奶犊牛分离到的1株致病菌(KMD3)进行鉴定及16Sr RNA基因系统发育分析。方法:对分离菌株进行革兰氏染色、培养特性观察、生化试验、动物试验、药物敏感性试验及16S r RNA序列分析并构建系统发育树。结果:该菌形态、菌落形态、生化鉴定结果与奇异变形杆菌(Proteus mirabilis,PM)一致;接种小白鼠表现出较强的致病性;对氨基糖苷类抗生素等高度敏感,而对β内酰胺类大部抗生素和磺胺类抗生素耐药;分离株16S r RNA基因序列在Gen Bank进行Blast比对,与公布的序列同源高达99.0%,系统发育树中KMD3与13个代表菌株均属同一分支,且与鼠源(HQ169118.1)、牛源(JQ975907.1)、山羊源(KP401767.1)同源性达100%。结论:此次分离菌株KMD3是奇异变形杆菌,具有较强的致病性和耐药性,该菌是造成此次断奶犊牛发病的主要原因。

口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫新技术研究与应用

本研究采用猪口蹄疫（FMD）灭活疫苗和合成肽疫苗、猪瘟（CSF）脾淋活疫苗和高致病性猪蓝耳病（HPPRRS）活疫苗同步两点免疫技术,对被免疫猪只分别进行了小组试验、免疫持续期观察等试验研究,并用ELISA方法定期对各阶段血清抗体进行检测,旨在探索一种适合基层应用的FMD、CSF、HPPRRS三种疫苗同步分点注射免疫技术,提高免疫密度和免疫效果,降低基层防疫人员劳动强度,提高工作效率,破解基层强制免疫工作难题。本研究得出下列结论：（1）建立了口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫技术方法并证明了其临床应用的可行性与科学性。（2）口蹄疫、猪瘟和高致病性猪蓝耳病三种疫苗同步两点免疫证明了三种疫苗同步分点免疫相互间未出现免疫干扰现象。同时,对应用三种疫苗同步两点免疫技术中各病种免疫效果的同步评估需在免疫后35-40d期间进行监测为佳。（3）三种疫苗同步两点免疫技术列入云南省2013年重大动物疫病免疫方案,在全省范围内推广应用至今。本研究证明了三种疫苗同步分点注射的可行性和科学性,并将三种疫苗同步两点免疫技术大面积应用于免疫工作,解决了困扰基层临床免疫的难点问题,为其临床应用提供了科学依据和数据支持,在生产实际的临床应用中具有重要意义。