基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响

目的:基于ERIC-PCR技术分析黄连解毒汤对2型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)大鼠肠道菌群结构及DNA同源性的影响。方法:从36只SD大鼠中随机选取6只作为对照组,其余大鼠给予高脂饲料联合1%链脲佐菌素(30 mg·kg^(-1))建立糖尿病模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、黄连解毒汤高剂量组(6.25 g·kg^(-1))、黄连解毒汤中剂量组(3.13 g·kg^(-1))、黄连解毒汤低剂量组(1.56 g·kg^(-1))及二甲双胍组(100 mg·kg^(-1)),每组各6只。各药物组按照相应剂量灌胃给药,对照组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续21 d。第7天、第14天及第21天灌胃后,收集大鼠粪便,提取肠道菌群DNA。利用ERIC-PCR技术和Sanger测序检测大鼠肠道菌群结构与DNA同源性。结果:灌胃第7天,对照组条带较多集中在100~750 bp;与对照组比较,模型组条带在1 000~2 000 bp的亮度增强,在300~750 bp的亮度减弱;与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在750 bp的亮度增强。灌胃第14天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在1 000 bp以上的亮度减弱。灌胃第21天,与模型组比较,黄连解毒汤各剂量组和二甲双胍组条带在300~750 bp的亮度增强。DNA测序结果显示,灌胃第21天,对照组500 bp条带的优势菌群为拟杆菌属、杜氏邓氏菌和金黄杆菌属;模型组400 bp和1 000 bp条带的优势菌群为梭菌目细菌、普拉梭菌、铜绿假单胞菌和杆菌属。灌胃第7天,黄连解毒汤高剂量组750 bp条带的优势菌群为布劳特菌和拟杆菌属;黄连解毒汤中剂量组200 bp条带的优势菌群为脆弱拟杆菌和拟杆菌属;黄连解毒汤低剂量组1 200 bp条带的优势菌群为双发酵副梭菌;二甲双胍组1 000 bp条带的优势菌群为大肠埃希杆菌。灌胃第14天,黄连解毒汤高剂量组700 bp条带的优势菌群为拟杆菌目细菌和假单胞菌;黄连解毒汤中剂量组550 bp条带的优势菌群为假锁杆菌属和链霉菌属;黄连解毒汤低剂量组350 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、杜氏邓氏菌和杆菌科细菌;二甲双胍组290 bp条带的优势菌群为弗格森埃希菌和大肠埃希杆菌。灌胃第21天,黄连解毒汤高剂量组1 000 bp条带的优势菌群为普雷沃氏菌属;黄连解毒汤中剂量组600 bp条带的优势菌群为Muribaculum gordoncarteri、杜氏邓氏菌和拟杆菌属;二甲双胍组400 bp条带的优势菌属为Muribaculum gordoncarteri、肠杆菌、普雷沃氏菌属、杆菌科细菌和杆菌属。结论:黄连解毒汤对T2DM大鼠的肠道菌群结构具有调节作用,菌群调节效果受药物剂量和治疗时间的影响。

胸骨悬吊剑突下途径与肋间入路胸腔镜胸腺切除术的临床对比研究

目的:分析胸骨悬吊剑突下胸腔镜途径胸腺切除术的临床疗效。方法:回顾性分析25例行胸骨悬吊剑突下途径与74例肋间入路胸腔镜胸腺切除术患者的临床资料,分析其手术时间、术后胸管引流量、术后住院时间、疼痛评分等情况间的差异。结果:剑突组与肋间组患者在年龄、性别、高血压、病灶长径、手术时间、术后引流量、疼痛评分方面差异均无统计学意义,而剑突组的淋巴结清扫个数多于肋间组,剑突组的术后住院时间短于肋间组,两者差异有统计学意义。结论:胸骨悬吊剑突下途径胸腔镜胸腺切除术治疗胸腺疾病更彻底,安全便捷,疗效满意,值得临床推广。

基于16S rRNA测序探究葛根芩连汤对抗生素相关性腹泻肠道菌群结构的影响

应用16S rRNA测序方法,观察葛根芩连汤对抗生素相关性腹泻SD大鼠肠道菌群结构的影响;将60只SD大鼠适应性喂养1周后,随机分为2组分别为空白组(C)(10只)和造模组(50只),其中空白组给予生理盐水灌胃,而造模组SD大鼠给予克林霉素250 mg/kg灌胃造模,两组均为1次/d,连续7 d。造模成功后,将其随机分为5组:丽珠肠乐组(P)、模型组(M)、葛根芩连汤高、中、低剂量组(GQD-H、GQD-M、GQD-L),每组10只。丽珠肠乐组(双歧杆菌活性菌胶囊,0.15 g/kg)、葛根芩连汤高剂量组(10.08 g/kg)、中剂量组(5.04 g/kg)低剂量组(2.52 g/kg)分别给予对应药物进行灌胃干预。空白组及模型组给予等体积生理盐水灌胃,1次/d。各组连续给药7 d后,在无菌操作下提取各组大鼠粪便DNA,进行16S rRNA测序并分析其结果。通过Alpha与Beta多样性分析发现,GQD具有增加抗生素相关性腹泻大鼠肠道菌群多样性的作用;GQD可在门水平增加厚壁菌门、拟杆菌门的丰度,在属水平增加乳酸杆菌属、拟杆菌属的丰度。通过LEfse分析,发现GQD能增加乳酸杆菌、拟杆菌丰度,降低变形菌丰度。提示GQD可能通过改善肠道微生态结构治疗抗生素相关性腹泻。

基于血清代谢组学研究黄连解毒汤对SD大鼠胆汁酸代谢的影响

目的 通过血清非靶向代谢组学技术研究黄连解毒汤对健康SD大鼠生理功能的影响。方法 大鼠24只适应性喂养7 d后,随机分为空白组(N组)、黄连解毒汤高剂量组(H组)、中剂量组(M组)、低剂量组(L组),每组6只。N组灌胃生理盐水,H组、M组、L组分别按照每次6.250 g/kg、3.125 g/kg、1.560 g/kg剂量灌胃1 mL、每天2次、连续21 d。采取大鼠血清样本前禁食禁水12 h,经麻醉后腹主动脉取血并分离血清。通过GC-TOF-MS检测各组大鼠血清中代谢产物的变化,采用多元分析OPLS-DA以及单变量统计学方法筛选其差异代谢物,再经过MetaboAnalyst平台进行代谢通路分析。结果 与N组相比,H组、M组、L组大鼠血清中显著改变的代谢小分子主要有胆固醇、胆酸、核糖、白皮杉醇、皮质醇、油酸、琥珀酸、亚麻酸、醋酸和丙酮醇等(P<0.05)。相关分析表明黄连解毒汤能显著影响机体的初级胆汁酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、α-亚麻酸代谢、甘油磷脂代谢,且其发挥体内作用可能与摄入的剂量有关,为深入揭示黄连解毒汤促进胆汁酸代谢的作用机制提供一定参考。结论 黄连解毒汤能促进体内初级胆汁酸生成并增强胆汁酸代谢通路的作用。

水沟穴治疗广泛性焦虑症疗效观察

目的通过观察应用水沟穴和未用水沟穴针刺治疗广泛性焦虑症的疗效差异,扩大水沟穴的应用范围,优化针灸治疗方案。方法将48例广泛性焦虑症患者随机分为治疗组(应用水沟穴组)和对照组(未用水沟穴组),两组均取百会、四神聪、太阳、风池、内关、神门,施捻转提插泻法,治疗组在此基础上加水沟穴,两组均每日治疗1次,4星期为1个疗程,采用HAMA焦虑量表评价两组疗效。结果治疗组愈显率为75.0%(18/24),优于对照组的45.8%(11/24)(P<0.05);两组患者治疗后HAMA评分较治疗前均明显降低(P<0.05);治疗组HAMA评分下降的幅度显著大于对照组(P<0.05)。结论针刺水沟穴能明显提高针灸治疗焦虑症的疗效,说明水沟穴具有抗焦虑作用。

基于16S rRNA高通量测序研究氨苄西林钠对SD大鼠肠道菌群结构的影响

通过16S rRNA高通量测序技术研究抗生素对SD大鼠肠道菌群多样性和结构的影响。SD大鼠40只随机分为4组:空白对照组(M0)10只、抗生素1周(M1)10只、抗生素2周(M2)10只,抗生素3周(M3)10只。其中空白组使用生理盐水灌胃,1 mL/次,2次/d,抗生素组用0.031 g/mL的氨苄西林钠,1 mL/次,2次/d灌胃,分别在1d、7d、14d、21d处死M0、M1、M2、M3组的10只SD大鼠,收集大鼠肠道内容物。提取样本DNA进行16S rRNA高通量测序并分析。结果表明,抗生素不同用药时长与空白对照组的肠道菌群的结构存在明显差异。与M0组相比,M1组的大鼠肠道菌群摩根氏菌属(Morganella)的丰度上升,苏黎世杆菌属(Turicibacter)丰度下降;M2组的大鼠肠道毛螺菌属(Lachnospiracea_incertae_sedis)丰度上升,Terrisporobacter丰度下降;M3组差异最小;抗生素能引起尿素循环降低和甲酰基-四氢叶酸的生物合成途径的升高。研究结果表明,广谱类抗生素氨苄西林钠破坏肠道菌群的稳态,能增加结肠息肉和抑郁症等疾病的风险,但在白血病和帕金森疾病上有潜在治疗价值。

基于GC-TOF-MS代谢组学研究黄连解毒汤对大鼠粪便代谢的影响

目的通过GC-TOF-MS代谢组学探讨不同剂量的黄连解毒汤对SD大鼠粪便代谢组的影响,进而为黄连解毒汤的作用机制提供参考。方法SD大鼠45只适应性喂养7天后,随机分为5组:黄连解毒汤高剂量组、中剂量组、低剂量组、抗生素组和空白组,每组9只。中药干预组不同剂量黄连解毒汤灌胃,1mL/次,2次/天,连续给药21天;抗生素组,1 mL/次,2次/天;空白组生理盐水灌胃,1 mL/次,2次/天,连续给药21天;末次给药后,禁食禁水12 h,处死并收集大鼠粪便。采用气相色谱-飞行时间质谱(Gas Chromatography Tandem Time-of Flight Mass Spectrometry,GC-TOF-MS)检测各组大鼠粪便,运用多元分析OPLS以及单变量统计学方法筛选差异代谢物,通过MetaboAnalyst平台进行代谢通路分析。结果对于粪便中的内源性代谢物小分子,高剂量组的黄连解毒汤影响的主要有:核糖、硫酸、棕榈酸、花生酸、茜素等;中剂量组的黄连解毒汤影响的主要有:乌头酸、胆固醇、乳酸、棕榈油酸、茜素等;低剂量组的黄连解毒汤影响的主要有:硫酸、棉子糖;氨苄西林钠影响的主要有:蛋氨酸1、麦角固醇、正亮氨酸1、棕榈酸、硫酸、乳酸等;不同剂量的黄连解毒汤和氨苄西林钠都能够影响到半乳糖代谢及硫代谢通路。结论黄连解毒汤可改善糖尿病和心脑血管疾病相关的代谢物小分子,不同剂量的黄连解毒汤对粪便代谢的影响不同,其中中剂量的影响最为广泛。

基于AHP-模拟综合评价法的景区夜间旅游体验度研究——以哈尔滨市中央大街为例

文章以夜间哈尔滨市中央大街旅游商业街区的游客体验度问卷调查为数据基础,依托模糊数学的理论与方法,利用AHP法计算各层指标的权重,结合模糊综合评价法、IPA分析法,对夜间中央大街旅游商业街区游客体验度的一级指标及二级测评指标进行重要程度、体验度的实证分析,并根据测评结果有针对性地提出中央大街夜间旅游要文旅融合发展的建议,以促进中央大街夜间旅游的积极发展。

葛根芩连汤对菌群失调性腹泻大鼠模型结肠组织PINK1/Parkin表达的影响

目的 通过观察葛根芩连汤(GQT)对菌群失调性腹泻大鼠模型动物结肠组织PINK1/Parkin表达水平的影响,探讨GQT治疗腹泻的作用机制。方法 180只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机分为空白组(30只)和造模组(150只),造模组采用复合抗生素灌胃法建立菌群失调性腹泻大鼠模型。模型成功后将造模组随机分为5组,即模型组、丽珠肠乐组、GQT高、中、低剂量组,30只/组。GQT高、中、低剂量组分别按7.02,3.51,1.755 g·kg^(-1),丽珠肠乐按0.125 g·kg^(-1)灌胃,1次/d,连续21 d,模型组和空白组给予蒸馏水灌服,各组灌胃体积均为10 mL/kg。分别在治疗后7、14、21 d进行样本采集。应用荧光定量PCR技术(RT-PCR)及免疫组化法(IHC)分析结肠组织PINK1/Parkin相对表达水平;应用免疫印迹法(WB)法检测P62、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达。结果 综合模型大鼠粪便、临床症状及电镜观察结果表明本次造模验证成功。RT-PCR分析PINK1和Parkin mRNA表达结果表明,模型组大鼠基因表达较空白组显著升高(P<0.05);GQT中、低剂量组较模型组显著下降(P<0.05)。IHC检测PINK1/Parkin蛋白表达水平,模型组大鼠较空白组显著升高(P<0.05);GQT干预后7 d和14 d后高剂量组较模型组PINK1蛋白均具有显著差异(P<0.05)。WB法检测P62、LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达,模型组大鼠P62蛋白表达水平较正常组P62蛋白表达水平显著降低(P<0.05);模型组大鼠LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达水平较正常组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白表达水平显著升高(P<0.05);葛根芩连汤干预14 d后中、低剂量组P62蛋白表达水平较模型组P62蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05);LC3Ⅰ/LC3Ⅱ高、低剂量组蛋白表达水平较模型组LC3Ⅰ/LC3Ⅱ蛋白表达水平具有显著差异(P<0.05)。结论 GQT可能通过调节自噬相关因子PINK1/Parkin及自噬相关标志物P62、LC3表达,进而改善菌群失调来治疗腹泻。

基于16S rRNA测序与网络药理学探讨葛根芩连汤干预抗生素相关性腹泻的作用机制

目的:通过16S rRNA测序与网络药理学探究葛根芩连汤(GQT)对抗生素相关性腹泻(AAD)肠道菌群的作用机制。方法:将60只SD大鼠随机平均分为空白组、模型组、丽珠肠乐组(0.15 g·kg^(-1))、葛根芩连汤高、中、低剂量组(10.08、5.04、2.52 g·kg^(-1)),除空白组外,各组每日均给予克林霉素(250 mg·kg^(-1))灌胃造模,连续7 d。造模成功后,各给药组按剂量灌胃对应药物,1次/d,持续14 d,空白组与模型组给予等体积生理盐水灌胃。通过中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选GQT活性成分及作用靶点,利用人类基因数据库GeneCards、在线人类孟德尔遗传(OMIM)数据库、药物遗传学与药物基因组学知识库(PharmGKB)、药品生物信息学和化学信息学数据库DrugBank、疾病相关的基因与突变位点数据库DisGeNET检索AAD疾病靶点,通过R软件分析获得“药物-疾病”共有靶点。利用STRING数据库分析靶点蛋白质-蛋白质相互作用关系,并进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。通过苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠结肠病理学改变,并结合16S rRNA测序AAD结肠内容物菌群结构验证网络药理学结果。结果:通过网络药理学从GQT中筛选出238个活性成分作用于276个成分靶点,其中槲皮素、葛根素、汉黄芩素、芹黄素为GQT主要核心成分,AAD疾病靶点1097个,药物-疾病交集靶点127个。蛋白质-蛋白质相互作用网络主要包括蛋白激酶B1(Akt1)、白细胞介素-6(IL-6)及IL-1β等核心靶点,主要富集于IL-17信号通路。通过动物实验验证发现,与空白组比较,模型组结肠结构严重异常,肠道上皮柱状细胞损伤、杯状细胞减少、大量炎症细胞浸润;与模型组比较,GQT高剂量组结肠结构有所改善,但仍存在异常;GQT中、低剂量组和丽珠肠乐组结肠结构明显改善,达到正常水平。GQT可改善AAD肠道菌群结构多样性,在门水平增加厚壁菌门Firmicutes丰度,降低拟杆菌门Bacteroidetes丰度,在属水平增加乳酸杆菌属Lactobacillus丰度,降低普雷沃氏菌属Prevotella与拟杆菌属Bacteroides丰度,其中乳酸球菌属Lactococcus可作为GQT治疗AAD的生物标记物,通过菌群功能代谢预测发现GQT可促进肠道中醋酸与乳酸代谢途径。结论:GQT可能通过槲皮素、汉黄芩素等关键成分作用于Akt1及IL-6等靶点,激活IL-17信号通路,同时改善肠道乳酸球菌属丰度及醋酸、乳酸代谢途径,从而发挥修复肠道屏障的作用来治疗AAD。

基于肠道菌群探究葛根芩连汤短期治疗抗生素相关性腹泻

目的探究葛根芩连汤(Gegen Qinlian Decoction,GQ)短期治疗对抗生素相关性腹泻(antibiotic-associated diarrhe-a,AAD)大鼠肠道菌群的影响。方法将80只SD大鼠适应性喂养1周后,根据随机双盲法分为8组(n=10):对照组0、1(N0、N1)、模型组0、1(M0、M1)、益生菌组(阳性对照组,P)、葛根芩连汤高、中、低剂量组(GQ-H、GQ-M、GQ-L)。除对照组外,其余各组灌胃克林霉素(250 mg/kg)制备AAD模型,1次/天,连续7天。大鼠出现腹泻后,分别于0天、3天麻醉后处死SD大鼠,无菌取结肠内容物备用。将两次所得粪便样本提取DNA,进行16S rRNA测序分析。结果克林霉素对肠道菌群多样性具有负面影响,在门水平克林霉素增加变形菌门相对丰度,而在属水平,克林霉素导致6个菌属相对丰度降低,包括瘤胃球菌、布劳氏菌、拟杆菌等。进一步代谢通路分析发现,克林霉素减少丁酸、乙酸等代谢通路;然而,经GQ治疗后,AAD大鼠肠道菌群结构明显改善,在门水平,GQ降低变形菌门相对丰度,在属水平,GQ增加梭菌和罕见小球菌相对丰度,并降低多种副杆状菌、颤螺菌相对丰度。在代谢通路方面,GQ增加硫胺素与精氨酸代谢通路。结论葛根芩连汤可能改善因长期服用克林霉素而引起的致病菌丰度增加及乙酸、丁酸代谢通路降低。

基于16S rRNA测序研究葛根芩连汤对菌群失调性腹泻大鼠肠道菌群结构的影响

目的:采用16S rRNA技术研究葛根芩连汤对菌群失调性腹泻大鼠肠道菌群结构的影响。方法:将60只健康SD大鼠随机分为6组,分别为正常组、模型组、葛根芩连汤高、中、低剂量组,丽珠肠乐组,每组10只。除正常组外,每日按头孢拉定178.6 mg·kg^(-1),硫酸庆大霉素31.25 mg·kg^(-1)混合抗生素进行灌胃造模,造模成功后,葛根芩连汤高、中、低剂量组灌胃葛根芩连汤(7.02,3.51,1.755 g·kg^(-1)),丽珠肠乐组按0.125 g·kg^(-1)灌胃,正常组与模型组给予无菌蒸馏水灌胃,体积分数均为10 mL·kg^(-1),连续给药7 d,将大鼠麻醉后取大鼠结肠内容物,提取粪便DNA后进行16S rRNA高通量测序并分析其结果。结果:葛根芩连汤明显调节菌群失调性腹泻模型大鼠的物种数量及Alpha与Beta多样性,提高菌群生物丰富度指数与多样性指数,正向调节菌群失调性腹泻模型大鼠的3种差异菌门(厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门)与14种差异菌属(拟杆菌属、狄氏副拟杆菌属、布劳特氏菌属等)。结论:葛根芩连汤对菌群失调性腹泻模型大鼠肠道菌群有调节作用,揭示了肠道菌群与菌群失调性腹泻之间的生理病理机制。

四君子汤对IEC-6细胞增殖相关指标及大鼠胃肠黏膜c-Myc表达的影响

目的观察四君子汤对IEC-6细胞(大鼠小肠上皮细胞)增殖,多胺调控生长相关基因细胞周期检测点激酶2(Checkpoint kinase 2,Chk2)、c-Myc表达,以及对大鼠胃肠黏膜c-Myc蛋白表达的影响。方法采用SD大鼠制备空白血清及四君子汤含药血清;无负荷细胞实验设空白对照组、腐胺组(10μmol·L^(-1))及四君子汤含药血清低、中、高(5%、10%、20%)剂量组;α-二氟甲基鸟氨酸(α-difluoromethylornithine,DFMO)负荷细胞实验设空白对照组、DFMO组(2.5 mmol·L^(-1))、腐胺组(10μmol·L;)及四君子汤含药血清低、中、高(5%、10%、20%)剂量组;动物实验将SD大鼠随机分为空白对照组、模型组(吲哚美辛组)及四君子汤低、高(5、15 g·kg^(-1))剂量组。采用MTT法检测IEC-6细胞增殖情况;qPCR法检测细胞Chk2、c-Myc mRNA表达;Western Blot法检测细胞Chk2、p-Chk2、c-Myc蛋白表达和大鼠胃肠黏膜的c-Myc蛋白表达。结果 (1)细胞实验:与空白对照组比较,10%、20%四君子汤含药血清可促进给药24 h后IEC-6细胞的增殖(P<0.01),提高p-Chk2蛋白及c-Myc m RNA/蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01);5%、10%、20%四君子汤含药血清可促进给药48、72 h后细胞增殖(P<0.01),促进Chk2 mRNA/蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。与DFMO组比较,5%、10%、20%四君子汤含药血清可促进给药48 h后细胞增殖(P<0.01),提高c-Myc mRNA/蛋白表达(P<0.05,P<0.01);10%、20%四君子汤含药血清可促进给药72 h后细胞增殖(P<0.01),促进Chk2及p-Chk2蛋白表达(P<0.05,P<0.01);20%四君子汤含药血清可促进Chk2 mRNA表达(P<0.05)。(2)动物实验:与模型组比较,四君子汤5、15 g·kg^(-1)可上调模型大鼠胃黏膜及小肠黏膜c-Myc蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论四君子汤可促进IEC-6细胞增殖,其作用机制可能与影响多胺信号通路,上调生长相关基因Chk2、c-Myc表达有关。四君子汤可提高胃肠黏膜损伤模型大鼠胃及小肠黏膜c-Myc蛋白表达水平。