猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝。分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性。表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测。

猪圆环病毒2型广东株全基因组的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组序列，设计2对特异性引物，对广东省不同地区规模化猪场采集的疑似断奶仔猪多系统消耗综合征（PMWS）组织病料进行了PCV2全基因组克隆和序列分析．结果表明，PCV2核苷酸序列较稳定，不同地区6个PCV2毒株全基因组序列均由1767bp组成，彼此间核苷酸序列相似性达95．3％～99．8％，亲缘关系密切；与GenBank已发表的国内不同地区PCV2参考毒株的相似性介于70．1％-99．1％；与欧洲各地区毒株的相似性介于67．7％～98．8％；其中与美国的毒株（AY094619）差异性最大，介于69．4％-70．8％之间．

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应。本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合。以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力。

2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明:所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1 DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93.8%～100%、93.7%～99.6%、91.7%～98.9%,氨基酸序列相似性分别为94.5%～100.0%、94.1%～99.2%、95.0%～99.2%。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71.4%～72.0%和78.2%～79.0%之间,与韩国新型DHV相似性在94.0%～95.1%和91.6%～93.3%之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97.9%～100.0%和97.5%～100.0%之间。VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1的高变区主要分布在46～64、95～149、180～223位,尤其是C′末端,存在点突变或连续变异。在第145～146位,15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸(G和G)。小RNA病毒科的VP1蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。

广东省猪圆环病毒2型感染的血清学调查

为了解广东省猪群中猪圆环病毒2型(PCV-2)的感染情况,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对广东部分地区的764份不同年龄段的猪血清进行PCV-2抗体检测,对PCV-2与猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)混合感染情况做了进一步调查。结果表明,PCV-2抗体检测平均阳性率为61.91%(473/764),其中断奶仔猪抗体阳性率为59.52%(322/541),后备母猪抗体阳性率为64.81%(35/54),经产母猪抗体阳性率为67.29%(72/l07),公猪抗体阳性率为70.97%(22/31);与PRV混合感染的阳性率为14.71%(35/238),与PRRSV混合感染阳性率为47.48%(113/238),三者混合感染的阳性率为8.82%(21/238)。调查表明,PCV-2感染在广东地区猪群中普遍存在。

益生菌替代肉鸡饲料中促生长抗生素的田间试验

在肉鸡养殖过程中大量使用促生长抗生素造成了严重药物残留、细菌耐药以及食品安全问题。寻找安全的促生长抗生素的替代品,保证食品安全已经成为全世界的焦点。益生菌和酸化剂作为潜在的抗生素替代品日益受到人们的重视。试验应用建明工业开发的益生菌替代抗革兰氏阳性AGP在中国某肉鸡一条龙企业下属农场进行两个批次的对比试验,总共使用了148 000羽肉鸡。抗生素对照组饲料中添加阿维拉霉素8 mg/kg,试验组每吨饲料添加克洛生200 g。第一个批次肉鸡平均43 d出栏,结果显示抗生素对照组的平均出栏体重、成活率、料肉比、欧洲效益指数分别为2.543 kg、93.19%、1.79和308;试验组平均出栏体重、成活率、料肉比、欧洲效益指数分别为2.559 kg、93.96%、1.73和323;与对照组相比试验组平均体重提高14 g,成活率提高0.77个百分点,料肉比降低0.06,欧洲指数提高15。第二个批次鸡群对照平均34日龄出栏,试验组平均33.5日龄出栏。结果显示抗生素对照组的平均出栏体重、成活率、料肉比、欧洲效益指数分别为1.735 kg、98.10%、1.64和308;试验组平均出栏体重、成活率、料肉比、欧洲效益指数分别为1.795 kg、97.7%、1.58和333。与对照组相比试验组平均体重提高60 g,料肉比降低0.06,欧洲指数提高25。连续两批鸡群试验结果表明,试验组益生菌替代该AGP后各项生产指标不仅没有负面影响,而且全面略优于抗生素对照组。该试验结果表明试验用的益生菌可以替代抗革兰氏阳性菌促生长抗生素在肉鸡养殖当中的应用。

PRRSV变异株ORF6基因重组杆状病毒的构建及其在昆虫细胞的表达

参照GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株ORF6(M蛋白)基因序列,设计合成了一对引物,扩增PRRSV ORF6基因。将该基因克隆于转移质粒载体pFcDNA3.1(+)中,获得重组转移质粒pFcDNA3.1-ORF6并将其转化DH10Bac细胞,得到重组穿梭质粒Bacmid-ORF6,再将其转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBacmid-ORF6,经PCR鉴定证实目的基因正确地插入到杆状病毒基因组的CMV启动子下游;经过间接免疫荧光试验(IFA)检测,M蛋白在Sf9细胞中得到了表达,而且表达的产物具有特异免疫学反应性。

2型猪圆环病毒感染对小鼠组织中Caspase3、Bak及Bcl-2基因表达的影响

Caspase3、Bcl-2、Bak是细胞凋亡过程中3种重要的调节蛋白,为研究感染猪圆环2型病毒(PCV2)后体内细胞的凋亡情况,本实验以BALB/c小鼠为实验模型,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测细胞凋亡的方法。结果表明实验组Caspase3的表达在各时间段里与对照组相比均呈上升趋势,提示了PCV2感染可以上调Caspase3水平,从而增加被病毒感染组织的细胞凋亡,而小鼠心、脑、脾等组织Bak基因表达明显上调,Bcl-2基因表达水平也伴随Bak基因而升高。这些结果揭示了PCV2感染BALB/c小鼠后,相关细胞凋亡基因在体内的作用与机制,同时为今后细胞凋亡的检测提供了新的方法。

猪圆环病毒2型感染对小鼠脾脏中IFN-γ基因表达的影响

本研究对PCV-2感染对小鼠组织中IFN-γ基因表达的影响进行了分析。分别取各基因RT-PCR扩增的回收产物进行序列稀释（10-1-10-6）,再进行实时荧光定量PCR扩增,扩增完毕后,进行熔解曲线分析,相对定量检测了PCV-2感染小鼠脾脏不同时段IFN-γ基因的表达水平。试验结果表明,得到定量标准曲线,起始模板浓度与Ct值之间呈良好的线性关系,-βactin基因标准曲线为y=-3.32x＋31.57,IFN-γ基因标准曲线为y=3.43x＋45.83,PCV-2感染小鼠后脾脏IFN-γ基因表达水平升高,但第14~28天IFN-γ基因表达水平呈下降趋势。

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因的克隆与原核表达

为原核表达猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF3编码蛋白,本研究采用PCR方法以PCV2的CC株的基因组DNA为模板扩增ORF3基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白约为31 ku,并且以包涵体形式存在;western blot分析表明,ORF3重组蛋白能够与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,表明原核表达的ORF3重组蛋白具有良好的反应原性。

猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5重组杆状病毒疫苗的研究

参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。

4株PRRSV GP5蛋白编码序列的序列测定和特性分析

针对PRRSV ORF5基因组设计了1对特异性引物,利用RT-PCR的方法,对在南方地区分离的4株PRRSV ORF5基因进行了基因扩增,克隆到pMD18-T载体后测序,获得了4株PRRSV ORF5基因全长603bp的核苷酸序列。利用生物信息学软件对4株PRRSV ORF5基因序列进行了遗传进化分析,结果显示GD1、GD2、GD3、GD4株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为87.1%、87.2%、87.1%和86.9%。利用系统进化树分析表明GD1、GD2、GD3、GD4株均属于美洲型。进一步采用序列分析软件对病毒结构蛋白推导糖基化位点比较,结果表明不同毒株GP5糖基化位点在基序和位置上均有所不同,这可能与毒株的毒力、免疫原性的差异相关,这些为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。

广东省猪圆环病毒2型全基因组序列的比较和分析

参考GenBank发表的猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）全基因组序列,设计引物,通过PCR技术,从广东地区疑似＂高热病＂病猪的组织中,扩增17株PCV2流行株的全基因,并进行了序列测定分析.结果表明,17个PCV2分离株基因组全长为1 767或1 768 bp.相似性比较发现,17个分离株之间的核苷酸相似性为96.7%-99.8%,与GenBank上已发表的国外分离株比较,相似性为95.6%-99.8%;17个分离株ORF2、ORF3的核苷酸相似性分别为89.5%-100%和97.5%-100%;系统发育树显示,17个毒株有2株属于a亚群,10株属于b亚群,5株属于d亚群.

猪圆环病毒2型CC株ORF3基因序列分析及真核表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP-N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3。对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2%-99.0%,氨基酸序列同源性为90.5%～98.1%。将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP-N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性。本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank收录的PRRSV基因序列,利用PRRSV经典变异株与缺失变异株NSP2基因序列特点,设计合成两对特异性引物,经RT-PCR扩增后,用T4连接酶将目的片段与pMD18-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH-5a株感受态细胞。提取的质粒经PCR、酶切和测序鉴定,证实为PRRSV缺失变异株与经典变异株的阳性重组质粒。将重组标准质粒进行10倍系列稀释后作为模板,通过实时荧光定量PCR法(Real-timePCR),建立了PRRSV缺失变异株与经典变异株的标准曲线及其直线回归方程,并确定其最佳读板温度。该方法具有线性关系好、特异性强、敏感性高、重复性好等特点,为鉴别诊断及分析PRRSV缺失变异株与经典变异株感染猪体内病毒的绝对含量提供了技术手段。

甘肃河西走廊两次强对流天气对比分析

使用地面高空观测资料、NCEP1°×1°6小时再分析数据和张掖CINRAD/CC雷达观测数据,对2006年7月7日、8月10日发生在甘肃河西走廊中部的两次强对流天气的环流形势、大气稳定度、相对风暴螺旋度(SRH)、天气雷达回波特征进行了对比分析。分析结果表明:产生这两次强对流天气环流形势不同。7月7日飑线对流系统产生于北部沙漠戈壁由北向南移动,右移飑线前部结构为气旋式旋转;8月10日对流系统产生于青藏高原由南向北移动,来自高原上的暖湿气流水汽充足,不稳定层比7月7日深厚,产生冰雹的左移超级单体结构为反气旋式旋转。7月7日右移飑线相对风暴螺旋度降雹前为正值,降雹开始后转为负值;8月10日左移反气旋超级单体相对风暴螺旋度在发展期为负值,降雹开始后跃增到60m2.s-2以上。

蛋鸡肠道健康与无抗产品的生产

据《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》《“十三五”国家食品安全规划》和《“十三五”国家农产品质量安全提升规划》所述,我国是畜禽、水产养殖大国,也是兽用抗菌药物生产和使用大国。兽用抗菌药物在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽水产品有效供给中发挥了重要作用;但动物源细菌耐药性上升,致使兽用抗菌药物疗效降低,迫使养殖用药增加,从而造成兽用抗菌药物毒副作用加剧、兽药残留超标风险提高,严重威胁畜禽水产品质量安全和公共卫生安全,给人类和动物健康带来很大隐患。综合治理兽用抗菌药物,遏制动物源细菌耐药性,是推动养殖业供给侧结构性改革,保障畜禽水产品质量安全的关键环节。

怎样提升小学语文个性化阅读的品质

文本的内涵非常丰富，学生对文本的反应往往是多元的。因此，教师在教学中要尊重学生的独特体验。《语文课程标准》指出：“阅读是学生的个性化行为，应让学生在主动积极的思维和情感活动中，加深理解和体验，尊重学生的独特体验。”我认为，个性化阅读教学，应该是在教师的指导下，学生对文中作者所提出的主题思想或文本所寄寓的价值观做出自己独特解读的阅读教学过程。本文结合课堂教学中个性化阅读的实践，从两个方面谈谈怎样提升小学语文教学中个性化阅读的品质。

实现群文阅读核心教学价值的途径和有效策略

阅读不只是学生需要具备的基本能力,更是关乎于个人成长与国家发展的重要内容。民族精神的厚重与丰富、书香社会的建设与发展、国家的繁荣与昌盛都离不开阅读。在对学生的教育当中,阅读素养的高低直接影响着学生的未来发展与人生方向,它是构成学生自身发展核心素养的重要组成部分。通过阅读提升学生的综合素养,帮助学生实现自身的个性化发展,这不仅仅是教育教学领域的重要内容,更是推动我国教育事业不断向前发展,切实落实人才培养的关键所在。在时代需求与社会发展的双重呼唤之下,群文阅读应运而生。群文阅读的出现为书香社会的建设以及学生核心素养的提升提供了有效的途径。

广东地区猪源戊型肝炎病毒的检测和核苷酸序列分析

为了检测广东地区部分猪场猪群中的猪源戊型肝炎病毒(HEV)RNA,试验利用反转录巢式聚合酶链式反应(RT-nPCR)并应用生物学软件将经扩增和测序得到的猪源HEV核苷酸序列与GenBank上的各个基因型HEV进行相似性比较分析。结果表明:5个样品中检测到HEV RNA,它们的相似性为85.1%～96.3%,与GenBank上基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型HEV序列的相似性分别为76.1%～80.5%、76.5%～79.4%、76.4%～80.2%、82.1%～97.7%。说明广东地区存在的猪源HEV可能属于在国内猪群中流行的基因Ⅳ型。