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小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测
被引量:
1
1
作者
张志人
安铁洙
+2 位作者
王子竹
朴善花
王春生
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2013年第5期49-53,共5页
为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs...
为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs逆转录病毒载体连接,然后依次经过酶切、PCR筛选阳性克隆和测序,最终构建逆转录病毒载体miR367-pMXs;采用磷酸钙法将miR367-pMXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,逆转录后获得cDNA,并采用Q-PCR方法检测侵染细胞中的miR367表达量。结果表明,被逆转录病毒侵染后,小鼠胚胎成纤维细胞中miR367的相对表达量比侵染前约提高了170倍。上述结果表明,成功构建小鼠miR367的逆转录病毒载体,为开展体细胞重编程机制的相关研究提供依据。
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关键词
细胞重编程
MICRORNA
miR367
逆转录病毒载体
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职称材料
microRNA在诱导体细胞重编程中的作用
被引量:
7
2
作者
王春生
张志人
+1 位作者
朴善花
安铁洙
《遗传》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第12期1545-1550,共6页
microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实,microRNAs广泛分布于真核生物,其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem c...
microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实,microRNAs广泛分布于真核生物,其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS)是将体细胞诱导成为具有胚胎干细胞性质的多潜能干细胞。iPS过程的核心为体细胞表观遗传状态发生重编程,因此,探明体细胞重编程机制对建立完善的iPS技术具有重要理论和实际意义。利用病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等因子导入体细胞的方法已不断发展,但"基因组整合"及原癌基因的参与增加了诱导细胞的致癌率。随着使用腺病毒、质粒或蛋白诱导等"非整合型"方法及L-myc的替换均可获得具有多潜能性的干细胞,癌变的风险大大降低。但其发生的理论机制仍不十分清楚。最近的研究证实,microRNAs影响体细胞的重编程过程,特别是miR302/367、miR200、miR-34和miR290/295等家族的microRNAs在体细胞诱导为iPS过程中发挥重要作用。文章就近年microRNA在诱导多能干细胞中的作用进行综述。
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关键词
MICRORNA
诱导多能干细胞
体细胞重编程
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职称材料
拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备
3
作者
王春生
罗芳
+3 位作者
张志人
赵健灵
朴善花
安铁洙
《四川动物》
CSCD
北大核心
2011年第4期506-509,共4页
为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b(+),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、...
为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b(+),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、切胶和与佐剂混合后作为抗原;皮下多点注射法将抗原注入新西兰大白兔皮下进行免疫;采集已免疫的兔血清,采用ELISA检测方法对其效价进行检测。结果显示,重组质粒2S-pET-52b(+)转化BL21-pLysS后获得最佳的表达菌株;在筛选得到的最佳IPTG、温度和时间(分别为1.0 mmol/L、30℃和2 h)条件下诱导获得2S-His重组蛋白;经免疫的4只兔血清中,2只兔的血清效价达1∶25 600和1∶12 800。表明利用2S-pET-52b(+)重组质粒成功获得可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清。本研究为加快建立在被毛中特异表达大量蜘蛛拖丝蛋白的新方法提供依据。
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关键词
蜘蛛拖丝蛋白
原核表达
蛋白纯化
抗血清制备
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职称材料
带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测
4
作者
渠俊杰
陈霞
+3 位作者
王春生
张志人
安铁洙
朴善花
《黑龙江动物繁殖》
2012年第1期8-11,共4页
为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成...
为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞(NIH3 T3细胞)后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX-Sox2-IRES-GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3 T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据。
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关键词
小鼠
Sox2基因
逆转录病毒载体
GFP
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职称材料
绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测
被引量:
1
5
作者
赵健灵
安铁洙
+3 位作者
张志人
王子竹
朴善花
王春生
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2012年第5期217-220,共4页
为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤...
为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。
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关键词
绵羊
成纤维细胞
Sox2基因
逆转录病毒载体
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职称材料
题名
小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测
被引量:
1
1
作者
张志人
安铁洙
王子竹
朴善花
王春生
机构
东北林业大学生命科学学院
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2013年第5期49-53,共5页
基金
国家自然科学基金项目(31000990)
中央高校基本科研业务费专项资金(DL10BA06)
文摘
为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs逆转录病毒载体连接,然后依次经过酶切、PCR筛选阳性克隆和测序,最终构建逆转录病毒载体miR367-pMXs;采用磷酸钙法将miR367-pMXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,逆转录后获得cDNA,并采用Q-PCR方法检测侵染细胞中的miR367表达量。结果表明,被逆转录病毒侵染后,小鼠胚胎成纤维细胞中miR367的相对表达量比侵染前约提高了170倍。上述结果表明,成功构建小鼠miR367的逆转录病毒载体,为开展体细胞重编程机制的相关研究提供依据。
关键词
细胞重编程
MICRORNA
miR367
逆转录病毒载体
Keywords
cell reprogramming
microRNA
miRNA367
retroviral vector
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
microRNA在诱导体细胞重编程中的作用
被引量:
7
2
作者
王春生
张志人
朴善花
安铁洙
机构
东北林业大学生命科学学院
出处
《遗传》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第12期1545-1550,共6页
基金
国家自然科学基金项目(编号:31000990)
中央高校基本科研业务费专项资金(编号:DL10BA06)资助
文摘
microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实,microRNAs广泛分布于真核生物,其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS)是将体细胞诱导成为具有胚胎干细胞性质的多潜能干细胞。iPS过程的核心为体细胞表观遗传状态发生重编程,因此,探明体细胞重编程机制对建立完善的iPS技术具有重要理论和实际意义。利用病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等因子导入体细胞的方法已不断发展,但"基因组整合"及原癌基因的参与增加了诱导细胞的致癌率。随着使用腺病毒、质粒或蛋白诱导等"非整合型"方法及L-myc的替换均可获得具有多潜能性的干细胞,癌变的风险大大降低。但其发生的理论机制仍不十分清楚。最近的研究证实,microRNAs影响体细胞的重编程过程,特别是miR302/367、miR200、miR-34和miR290/295等家族的microRNAs在体细胞诱导为iPS过程中发挥重要作用。文章就近年microRNA在诱导多能干细胞中的作用进行综述。
关键词
MICRORNA
诱导多能干细胞
体细胞重编程
Keywords
microRNA
iPS
somatic reprogramming
分类号
Q813 [生物学—生物工程]
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职称材料
题名
拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备
3
作者
王春生
罗芳
张志人
赵健灵
朴善花
安铁洙
机构
东北林业大学生命科学学院
出处
《四川动物》
CSCD
北大核心
2011年第4期506-509,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(30571325
30771538)
黑龙江省博士后基金项目
文摘
为了制备可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清,利用前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白基因重组原核表达载体2S-pET-52b(+),采用原核表达方法获得大量重组蜘蛛拖丝蛋白2S-His,对此重组蛋白进行His标签特异性的亲和纯化,再依次经SDS-PAGE、切胶和与佐剂混合后作为抗原;皮下多点注射法将抗原注入新西兰大白兔皮下进行免疫;采集已免疫的兔血清,采用ELISA检测方法对其效价进行检测。结果显示,重组质粒2S-pET-52b(+)转化BL21-pLysS后获得最佳的表达菌株;在筛选得到的最佳IPTG、温度和时间(分别为1.0 mmol/L、30℃和2 h)条件下诱导获得2S-His重组蛋白;经免疫的4只兔血清中,2只兔的血清效价达1∶25 600和1∶12 800。表明利用2S-pET-52b(+)重组质粒成功获得可用于拟蜘蛛拖丝蛋白体外检测的抗血清。本研究为加快建立在被毛中特异表达大量蜘蛛拖丝蛋白的新方法提供依据。
关键词
蜘蛛拖丝蛋白
原核表达
蛋白纯化
抗血清制备
Keywords
spider dragline silk protein
prokaryotic expression
protein purification
preparation of anti-serum
分类号
Q51 [生物学—生物化学]
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测
4
作者
渠俊杰
陈霞
王春生
张志人
安铁洙
朴善花
机构
东北林业大学生命科学学院
出处
《黑龙江动物繁殖》
2012年第1期8-11,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(31000990
30771538)
中央高校基本科研业务费专项资金资助(DL10BA06)
文摘
为了建立体细胞重编程过程中检测Sox2基因表达变化的方法,本研究利用克隆获得的小鼠Sox2基因与逆转录病毒载体pMX-IRES-GFP连接,构建带有报告基因GFP的逆转录病毒载体,将其转染293GP细胞后获得假病毒上清。将获得假病毒上清侵染小鼠成纤维细胞(NIH3 T3细胞)后观察GFP的表达和检测Sox2转录量的变化。其结果,成功构建带有GFP的Sox2基因逆转录病毒载体pMX-Sox2-IRES-GFP;将构建的载体转染后293细胞后获得能侵染NIH3T3细胞的假病毒上清,且与未侵染的NIH3 T3细胞相比,侵染后的NIH3T3细胞的Sox2表达量提高近10倍。本研究为开展在体细胞重编程过程中Sox2表达与重编程效率的相关性提供依据。
关键词
小鼠
Sox2基因
逆转录病毒载体
GFP
Keywords
Mouse
Sox2 Gene 4
Retrovirus Vector
GFP.
分类号
S814.3 [农业科学—畜牧学]
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职称材料
题名
绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测
被引量:
1
5
作者
赵健灵
安铁洙
张志人
王子竹
朴善花
王春生
机构
东北林业大学生命科学学院
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2012年第5期217-220,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(31000990
30771538)
中央高校基本科研业务费专项资金(DL10BA06)资助
文摘
为建立利用内源诱导因子诱导绵羊体细胞为多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)的方法,对绵羊Sox2基因进行克隆,并与pMXs连接构建逆转录病毒载体,将构建的载体转染293GP细胞以获得假病毒上清,利用假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞以检测细胞中的Sox2表达变化。PCR和酶切鉴定结果显示,成功构建了pMXs-Sox2重组质粒,该质粒具有转染293GP细胞的能力,所获得的假病毒上清侵染绵羊胎儿成纤维细胞后,可诱导细胞表达Sox2基因。本研究为开展绵羊iPS的相关研究提供依据。
关键词
绵羊
成纤维细胞
Sox2基因
逆转录病毒载体
Keywords
sheep
fibroblasts cell
Sox2 gene
retrovirus vector
分类号
S816.79 [农业科学—饲料科学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测
张志人
安铁洙
王子竹
朴善花
王春生
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2013
1
下载PDF
职称材料
2
microRNA在诱导体细胞重编程中的作用
王春生
张志人
朴善花
安铁洙
《遗传》
CAS
CSCD
北大核心
2012
7
下载PDF
职称材料
3
拟蜘蛛拖丝蛋白基因重组蛋白的纯化及其抗血清制备
王春生
罗芳
张志人
赵健灵
朴善花
安铁洙
《四川动物》
CSCD
北大核心
2011
0
下载PDF
职称材料
4
带有GFP的小鼠Sox2基因逆转录病毒载体的构建及其检测
渠俊杰
陈霞
王春生
张志人
安铁洙
朴善花
《黑龙江动物繁殖》
2012
0
下载PDF
职称材料
5
绵羊Sox2基因逆转录病毒载体的构建与检测
赵健灵
安铁洙
张志人
王子竹
朴善花
王春生
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2012
1
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职称材料
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