逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因的稳定转染细胞系的建立

目的应用Slingshot(SSH)-1L重组逆转录病毒载体,建立过表达该基因的稳定转染细胞系。方法用脂质体法将含SSH-1L的重组逆转录病毒载体pLNCX-SSH-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染MG63细胞,G418筛选。结果应用pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,获得滴度为5×108 CFU/L的病毒上清,感染MG63细胞,获得了过表达SSH-1L基因的MG63细胞。结论应用SSH-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的稳定细胞系。

体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为心肌细胞实验方法的建立

目的:探讨体外培养并诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化为心肌细胞(CMs)的实验方法。方法:采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs,采用5-氮杂胞苷(5-Aza)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对hMSCs进行联合诱导,诱导3～4周,观察细胞形态学的变化,免疫组织化学方法鉴定肌细胞及心肌细胞特异蛋白的表达。结果:hMSCs体外经5-Aza和bFGF联合诱导1～2周后,细胞体积较诱导前增大,呈长梭形。诱导2～3周后细胞伸出伪足呈多爪形;诱导3～4周后细胞伪足间相互连接形成肌管样结构。联合诱导3～4周后免疫组织化学鉴定结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白(cTnⅠ)和横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)表达均呈阳性。结论:hMSCs在体外经5-Aza和bFGF联合诱导可以分化为CMs。

逆转录病毒介导的靶向人Slingshot-1L基因稳定转染人骨髓间充质干细胞系的建立

目的建立过表达该基因的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)稳定转染细胞系。方法采用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离、纯化hMSCs。应用脂质体法将Slingshot-1L重组逆转录病毒载体pLNCX-Slingshot-1L转染PA317包装细胞,G418筛选,滴度测定。收集病毒上清感染第2代hMSCs,G418筛选,挑选阳性克隆,扩增培养。结果采用密度梯度离心法联合贴壁培养法成功分离、纯化了hMSCs,应用pLNCX-Slingshot-1L重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞,获得滴度为5×108CFU/L的病毒上清。收集病毒上清感染hMSCs,获得了过表达Slingshot-1L基因的hMSCs。结论应用Slingshot-1L重组逆转录病毒载体,成功建立了过表达该基因的hMSCs稳定转染细胞系。

人脂肪干细胞向内皮分化最佳诱导体系的建立

目的探讨人脂肪干细胞(human Adipose-derived stem cells,hADSCs)体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系。方法利用胶原酶消化法和贴壁筛选法从人脂肪组织中分离、培养及扩增hADSCs,分3组分别进行内皮诱导:即纤维连接蛋白(fibronectin,FN)包被组、明胶包被组和未铺组;同时诱导液分为两组:单纯内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)组及内皮细胞生长培养基(EGM2-MV)+50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF165)组。诱导15d后,通过流式细胞术检测各组内皮细胞特异性表面抗原CD34的表达;通过相差显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征。结果体外分离、培养出高度同源性的hADSCs,CD29、CD44、CD90、CD105及CD166呈阳性表达,而CD34、CD45及HLA-DR呈阴性表达;诱导后细胞流式结果显示单纯EGM-2MV诱导的3组细胞内皮细胞特异性标志CD34阴性表达,而EGM2-MV+50ng/mlVEGF165诱导的细胞,其中FN包被组CD34表达率为8.4%,明胶包被组为5.4%,未铺组为4.2%;相差显微镜下可见诱导后细胞呈三角形或多边形,融合处呈铺路石样生长。结论FN作为细胞外基质与EGM2-MV+50ng/mlVEGF165组成的诱导液协同作用,构成了hADSCs体外分化为内皮细胞的最佳诱导体系,可为临床上缺血性疾病的自体细胞移植治疗提供大量的种子细胞来源。

转移潜能不同的人前列腺癌细胞系差异膜蛋白质组学的分析

目的:通过应用鸟枪法蛋白质组学技术发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志。方法:应用鸟枪法蛋白质组学技术,比较人高转移前列腺癌细胞株(PC-3M)和人低转移前列腺癌细胞株(PC-3)间膜蛋白表达的差异。用SDS-PAGE胶分离膜蛋白,并且进行胰酶消化,用反相液相色谱分离肽混合物后进行ESI-MS/MS鉴定,用数据库查询结合生物信息学技术比较分析并识别细胞间的差异表达膜蛋白。结果:1)利用Gel-1DLC-MS/MS分析,在严格的过滤参数条件下鉴定了PC-3和PC-3M两种细胞中的蛋白,在PC-3细胞中鉴定了2172个蛋白,在PC-3M细胞中鉴定了2023个蛋白。2)用GOA分析软件进行分类,PC-3细胞中1499个蛋白为已知细胞组分,其中564(38.13%)个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白;PC-3M细胞中1391个蛋白为已知细胞组分,细胞组分中527(38.30%)个为膜蛋白或者膜相关蛋白。几个假设蛋白和cDNA序列也被预测。3)用蛋白名称和IPI数据库号对比分析后发现有161个蛋白质仅在PC-3前列腺癌细胞株中检测到有表达,135个蛋白质仅在PC-3M中检测到有表达。结论:人高、低转移前列腺癌细胞株的膜蛋白表达存在明显差异,为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据。

术前细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白在诊断甲状腺乳头状癌淋巴结转移中的应用及影响因素

目的:探讨术前细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白(washout fluid thyroglobulin in fine-needle aspiration,FNA-Tg)在诊断甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)淋巴结转移中的应用及影响因素。方法:回顾性分析2015年9月至2016年12月浙江大学医学院附属邵逸夫医院131例经病理证实为PTC且术前进行可疑淋巴结FNA及FNA-Tg测定的患者资料,以细针穿刺、手术病理或随访结果为"金标准",绘制ROC曲线计算FNA-Tg最佳诊断阈值,比较各检测方法(FNA、FNA-Tg和FNA+FNA-Tg)的诊断效能。进一步分析淋巴结解剖学分区、相关实验室指标对FNA-Tg诊断准确性的影响。结果:本研究中FNA-Tg的最佳诊断阈值为1.295 ng/mL。两者联合法诊断效能最佳,灵敏度及特异度分别达96.4%和99.2%。FNA-Tg在诊断侧颈淋巴结转移准确性较好,血清甲状腺球蛋白(serum Tg,sTg)是FNA-Tg>1.295 ng/mL的独立预测因子,OR值为1.018。结论:FNA-Tg是术前诊断PTC淋巴结转移,尤其是侧颈淋巴结转移的重要方法。1.295 ng/mL可以成为最佳诊断阈值的参考值之一,但sTg较高时,FNA-Tg的解读需要谨慎。

FNA-Tg测定在细针穿刺诊断甲状腺癌术后侧颈区可疑肿大淋巴结中的应用价值

目的 评价超声引导下细针穿刺洗脱液中甲状腺球蛋白（FNA-Tg）测定在细针穿刺（FNA）诊断甲状腺乳头状癌（PTC）术后侧颈区可疑肿大淋巴结中的价值.方法 回顾性分析112例PTC术后患者的128枚侧颈区超声显示为可疑肿大的淋巴结,行FNA及FNA-Tg测定,以手术病理为金标准,对具有不同超声特征数下FNA、FNA-Tg联合FNA（简称联合法）诊断转移性淋巴结的价值进行比较.结果 FNA、联合法诊断转移性淋巴结的敏感度、特异度、准确率分别为67.5％、98.0％、79.7％;87.0％、100.0％、92.2％,两者比较在敏感度、准确率方面差异有统计学意义（χ^2 =8.319,P=0.004;χ^2 =8.275,P =0.004）.可疑肿大淋巴结具有1个超声特征时,FNA、联合法诊断转移性淋巴结的敏感度、特异度、准确率分别为38.1％、95.7％、68.2％;71.0％、100.0％、86.4％,两者比较在敏感度、准确率方面差异有统计学意义（χ^2=4.709,P=0.030;χ^2 =4.141,P=0.042）;具有2个超声特征时,FNA、联合法诊断转移性淋巴结的敏感度、特异度、准确率分别为55.0％、100.0％、73.5％;90.0％、100.0％、94.1％,两者比较在敏感度、准确率方面差异有统计学意义（χ^2=6.140,P=0.013;χ^2=5.314,P=0.021）;具有0个、3个、4个或5个超声特征时,两者对转移性淋巴结诊断价值的差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 联合法有助于PTC术后转移性淋巴结的诊断,当可疑肿大淋巴结具有1个或2个超声特征时,两者联合后提高了单独FNA诊断的敏感度及准确率,但对于具有0个或2个以上超声特征的淋巴结,联合FNA-Tg未明显提高单独FNA的诊断价值.

术前超声引导淋巴结细针穿刺检查联合洗脱液甲状腺球蛋白测定对诊断甲状腺乳头状癌侧颈部淋巴结转移的价值

目的探讨采用超声引导下淋巴结细针穿刺（FNA）细胞学＋洗脱液甲状腺球蛋白测定（FNA—Tg）双重检查法对甲状腺乳头状癌术前侧颈部淋巴结转移的诊断价值。方法选取205例甲状腺细针穿刺细胞学检查证实为甲状腺乳头状癌并且超声发现有可疑侧颈部淋巴结肿大的术前患者，高频超声引导下均行淋巴结FNA和洗脱液FNA—Tg测定．所有淋巴结经手术切除，并送组织病理学检查。结果205例患者中共检出240个淋巴结，病理证实淋巴结转移184个。FNA细胞学检查判定为阳性淋巴结者162个，阴性者78个，诊断侧颈部淋巴结转移的准确性、敏感性、特异性为87．5％、85．0％、92．8％；洗脱液FNA—Tg检测判定阳性淋巴结168个，阴性淋巴结72个，诊断侧颈部淋巴结转移的准确性、敏感性、特异性为90．0％、89．1％、92．9％；两种方法联合（FNA＋FNA—Tg）判定阳性淋巴结172个，阴性淋巴结68个，诊断侧颈部淋巴结转移的准确性、敏感性、特异性为95．O％、93．5％、100％。FNA＋FNA—Tg联合诊断甲状腺乳头状癌侧颈部淋巴结转移的准确率较单一诊断方法高，差异有统计学意义（z。=8．454，P=0．004；Y。=4．324，P=0．038）。结论FNA细胞学检查与洗脱液FNA—Tg浓度检测联合使用可提高诊断准确率。

高频超声引导下细针抽吸活检结合细针抽吸洗脱液甲状腺球蛋白检测对甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结转移的诊断价值

目的 探讨高频超声引导下细针抽吸（FNA）细胞学结合细针抽吸洗脱液甲状腺球蛋白（FNA-Tg）检测对甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结转移的诊断价值.方法 回顾性分析甲状腺乳头状癌术后,临床随访中超声检查怀疑有颈部淋巴结转移患者65例,共79个异常淋巴结在高频超声引导下行FNA细胞学检查,同时以生理盐水冲洗细针针管,化学发光免疫测定法检测洗脱液中的甲状腺球蛋白（Tg）含量,所有淋巴结均经手术切除（包括颈部淋巴结清扫术）,并送组织病理学检查.结果 65例患者中,共检出79个可疑转移性淋巴结并对其进行细针穿刺,经术后组织病理证实的淋巴结转移阳性者共62个,阴性者17个.FNA细胞学检查判断为阳性淋巴结者54个,阴性者25个,FNA细胞学检查诊断颈部的淋巴结转移的准确性89.87％ （71/79）,敏感性87.10％（54/62）,特异性100％（17/17）,阳性预测值100％（54/54）,阴性预测值68.00％（17/25）.洗脱液FNA-Tg检测判定阳性淋巴结65个,阴性淋巴结14个.洗脱液FNA-Tg诊断颈部淋巴结转移的准确性96.20％ （76/79）,敏感性100％（62/62）,特异性82.35％（14/17）,阳性预测值95.38％（62/65）,阴性预测值100％（14/14）.FNA细胞学检查与FNA-Tg检测诊断甲状腺乳头状癌颈部淋巴结转移的准确率比较,差异无统计学意义（x2=1.454,P=0.228）.FNA细胞学检查假阴性的8个淋巴结在结合FNA-Tg检测结果后均获得了正确诊断.结论 FNA细胞学检查与FNA-Tg浓度检测均为甲状腺乳头状癌术后诊断淋巴结转移的有效手段.二者可以相互补充,早期、准确判定甲状腺乳头状癌术后颈部淋巴结转移情况.