新型靶向治疗人表皮生长因子受体2过表达乳腺癌

乳腺癌（breast cancer）是一种多基因参与、多步骤发生的高度异质性肿瘤,其病理和组织学分类相同的患者对同一治疗的疗效反应存在很大的差别。随着分子生物学的发展,乳腺癌诊断从传统的病理学和组织学分类,走向了以分子标志物为基础的预测方案。乳腺癌的分子特征更精确预测疾病复发风险,指导治疗用药选择。

铜、镉、铅离子对水螅摄食行为的抑制作用

参照GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中Ⅰ类标准(GB-Ⅰ)的重金属限量值,探索了Cu2+、Cd2+、Pb2+浓度对水螅摄食行为的抑制作用。结果发现,这3种离子抑制水螅摄食行为的2 min最低可见效应浓度ρLOE,Cu2+的低于其GB-Ⅰ的限量值,Cd2+、Pb2+的略高于其GB-Ⅰ的限量值;与24 h暴露于相同浓度重金属溶液的ρLOE接近。Cu2+的2 minρLOE与7 d暴露于Cu2+的ρLOE相同。结果提示,利用水螅摄食行为检测水体微毒性的方法比以往方法更简便、快速、准确,在水体微毒检测方面具有广泛的应用前景。

生物样本信息资源库的国内外研究进展

标准化的生物样本信息资源库是基因组、功能基因组等生命科学研究的关键源头，是将科研成果快速转化为医疗产品，应用到临床的重要保证，也是生物医药研发自主创新体系中至关重要的环节。英国、加拿大、挪威、瑞典、冰岛等国家早已建立了自己的生物样本信息资源库。

25-羟基维生素D_3人工完全抗原的合成与鉴定

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。

抗结核分枝杆菌DNA疫苗的构建及免疫原性研究

目的:构建抗结核分枝杆菌(TB)DNA疫苗并进行体内外的鉴定。方法:采用PCR技术分别扩增TB(H37Rv)抗原单基因Ag85a、Ag85b以及融合基因Ag85a-Esat6和Ag85b-Esat6融合基因,其5'端均含人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽,将目的基因分别亚克隆于p VAX1真核表达载体,得到Ag85a/p VAX1、Ag85b/p VAX1、Ag85a-Esat6/p VAX1和Ag85b-Esat6/p VAX1四种质粒;经酶切和测序鉴定正确后,质粒转染COS-7细胞48 h,取上清液检测目的蛋白表达情况;利用在体电脉冲技术(EP)将质粒注射BALB/c小鼠双侧胫前肌,检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果:四种质粒基因片段方向、序列正确;Western blot检测COS-7细胞转染48 h后的上清,均有清晰特异性的目的蛋白条带,并定量检测到Esat6蛋白的表达水平可达10 ng/ml;小鼠免疫实验结果表明,仅质粒Ag85b/p VAX1和Ag85a-Esat6/p VAX1可诱导针对结核抗原分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答和特异性杀伤应答,其中通过ELISA检测小鼠血清的lg G和ELISPOT检测脾细胞分泌IFN-γ的实验结果阳性率均为100%,且Ag85a-Esat6/p VAX1的效果较好些,与卡介苗具有显著性差异。结论:成功构建了抗TB的DNA疫苗,其中Ag85a-Esat6/p VAX1质粒DNA疫苗的免疫效果较好,为进一步研发治疗性的TB DNA疫苗奠定基础。

HBV微环DNA重组质粒的构建及初步药效学实验

目的构建HBV的治疗性微环质粒并进行体内外实验研究。方法采用聚合酶链式反应扩增HBV包膜蛋白pre S2.S抗原基因和h IL-2-IFNγ融合基因,将2个基因分别克隆于ZY781载体,得到亲本质粒pre S2.S/ZY781和h IL-2-IFNγ/ZY781,测序正确后,用阿拉伯糖诱导生成微环质粒p MCS2.S和p MCIIF。转染微环质粒于COS-7细胞株,用酶联免疫吸附法定量法检测24、48、72 h时目的蛋白的表达情况。双质粒联合在体电脉冲注射BALB/c小鼠,4周后处死小鼠,检测特异性的体液和细胞免疫应答。结果微环质粒p MCS2.S和p MCIIF转染COS-7细胞后,目的蛋白HBs Ag、白细胞介素-2、干扰素γ在不同时间均有表达,在48 h达峰值,分别为(60.3±7.8)、(17.7±1.9)、(10.3±0.9)ng/ml。微环质粒p MCS2.S能诱导小鼠产生HBs Ab的抗体保护,佐剂p MCIIF可显著增强其免疫效果,在低剂量5μg/只就能诱导较强特异性细胞和体液免疫。结论成功构建了HBV微环质粒p MCS2.S及其佐剂微环质粒p MCIIF,其有较好的体内外活性。

新型环状引物荧光定量PCR检测乳腺癌组织HER2基因mRNA表达方法的建立

目的研究建立一种基于实时荧光定量PCR技术和新型环状引物的简捷、准确、廉价、易于标准化检测乳腺癌组织人表皮生长因子受体2（HER2）基因mRNA表达水平的方法，为临床上肿瘤个性化分子靶向药物治疗提供用药指导。方法设计HER2和内参基因的新型特异性环状引物，通过Excel在乳腺癌组织标本中随机抽取5份标本检测候选内参基因的表达，同时用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件筛选和评估乳腺癌组织中稳定表达的内参基因，设置Mg“浓度和引物浓度梯度对PCR体系进行优化，建立乳腺癌HER2基因mRNA表达水平的新型环状引物EvaGreen染料实时荧光定量逆转录（FQRT）一PCR检测方法（以下简称“自建FQRT。PCR”法），并对其灵敏度、特异性、稳定性进行评价；同时用自建FQRT—PCR法与免疫组织化学（IHC）法平行检测2008至2012年厦门大学附属中山医院普外科收集的55份乳腺癌组织和其中32份同一患者匹配的正常组织（距癌组织1〉5cm）中HER2基因的表达水平，并评价自建FQRT—PCR法对乳腺癌的诊断效能。结果自建FQRT—PCR法对HER2基因和核糖体蛋白L37a（RPL37A）基因的最低检测限均为10^6拷贝／μl，线性范围均为10。～10。拷贝／pJ（r=0．997）；HER2和RPL37A基因的高、低浓度标准品（10^6拷贝／μl和10^1拷贝／μl）批内变异系数（CV）分别为（5．93±0．57）％和（5．11±0．59）％、（2．49±0．81）％和（2．984-0．97）％；批间CV为（5．76±0．58）％和（7．71±0．61）％、（3．75±0．76）％和（4．40±0．96）％。FQRT—PCR法与IHC法平行检测87份乳腺癌组织标本HER2基因表达水平，FQRT—PCR法的敏感度为96．36％（53／55），特异度为78．13％（25／32），阳性预测值为88．33％（53／60），阴性预测值为92．59％（25／27），与IHC检测结果总符合率为89．66％（78／87）。且与IHC法具有较高的一致性（Kappa=0．770，P〉0．05）。结论成功建立了FQRT—PCR检测乳腺癌HER2基因mRNA表达水平的方法，该方法敏感度高、特异度好且快速、价廉，适合临床检验实验室进行肿瘤标本的HER2基因表达检测。

一种靶向治疗肺癌的TV-BIKDD质粒的纯化及检定

目的提取、纯化靶向治疗肺癌的质粒TV-BIKDD,并进行质量检定。方法采用碱裂解法对工程菌DH5α/TVBIKDD菌体进行质粒初提,通过两步整体柱层析(离子柱层析和疏水柱层析)进行质粒纯化,并检测质粒含量、DNA超螺旋比例;用该方法连续纯化3批以超螺旋质粒DNA为样品的溶液制剂,对纯化后的质粒进行质量检定。结果质粒初提液经离子柱层析纯化后,去除了大量的RNA和蛋白质,再经过疏水柱层析纯化,最终获得的质粒DNA超螺旋比例为95.21%以上,质粒总回收率为78%。纯化后的3批溶液制剂全面质量检定结果均符合美国FDA标准以及我国人基因治疗用产品的技术指导原则规定。结论建立了稳定的TV-BIKDD质粒的纯化工艺,为进一步制备临床药用级样品的规模化工艺研究奠定了基础。