家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统建立

自CRISPR/Cas9基因编辑系统成功应用于模式生物以来,因其快速、高效、便捷等特点,广泛应用于基因功能研究、基因治疗和基因工程等研究领域。与此同时,CRISPR/Cas系统不断在微生物界的发现也加速了新的基因编辑工具的不断涌现。CRISPR/Cpf1是第二类(Ⅴ型)能够编辑哺乳动物基因组的CRISPR系统,相比于CRISPR/Cas9基因编辑系统,能够利用5′T-PAM富集区增加基因组覆盖率,具有其切割位点为粘性末端和更不易同源重组修复等诸多优势。基于此,本研究构建了能够在家蚕细胞表达的3个不同来源的CRISPR/Cpf1 (AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1)表达载体,选择高度保守的家蚕热休克蛋白基因BmHSP60和家蚕ATP酶家族BmATAD3A基因分别设计靶标gRNA,构建gHSP60-266R和gATAD3A-346R基因编辑载体。通过T7E1酶切分析和T克隆测序,鉴定3个Cpf1基因编辑系统AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1对靶标基因BmHSP60和BmATAD3A的编辑效率。同时,利用Western blotting分析不同基因编辑系统敲除靶基因后对其BmATAD3A和BmHSP60蛋白翻译的影响。本研究成功构建了家蚕CRISPR/Cpf1基因编辑系统,能够在家蚕细胞中有效编辑家蚕基因组,为家蚕基因功能研究、基因工程和遗传育种开发了新技术与新方法。

家蚕抗性品系NC99R抗BmNPV作用机制分析

家蚕Bombyxmori是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,由家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)引起的家蚕血液型脓病每年给我国蚕桑产业造成巨大的经济损失。文中拟通过鉴定目前存在的家蚕抗病毒品系NC99R抗性特征,初步解析其抗BmNPV机制,以期为家蚕抗病品系分子机制解析提供一定参考。将对照组大造(Dazao,DZ)品系和实验组NC99R抗性品系家蚕幼虫分别定量添食BmNPV包涵体(Occlusion bodies,OB),计算DZ和NC99R品系对BmNPV的半致死剂量(Median lethal dose,LD50),结果显示DZ品系半致死剂量为1.2×10^5多角体/头,抗性品系NC99R的半致死剂量为1.8×106多角体/头,抗性水平相比对照组提高15倍左右。进一步统计分析DZ和NC99R品系口服感染1×10^6多角体/头和体腔注射1×10^6粒子/头出芽型病毒粒子(Budded virus,BV)后的死亡率,结果显示DZ品系死亡高峰集中在第4–6天,NC99R抗性品系死亡高峰集中在第6–8天,与对照相比延迟1–2 d。通过RT-PCR分析BmNPV DNA拷贝数,显示DZ在口服感染和体腔注射后BmNPV基因组都快速增殖,抗性品系NC99R BmNPV DNA拷贝数缓慢增加。HE染色分析显示DZ和NC99R品系在口服感染前期没有显著差异,感染到96 h,DZ中肠细胞核变大,成脱落趋势;而抗性品系NC99R,细胞核膨大,但细胞排列仍较整齐。RT-PCR分析病毒不同时期基因表达显示抗性品系NC99R在口服感染和体腔注射24h后早期基因ie-1开始下调表达,其他时期基因随即下调表达;最后维持在较低表达水平或消失。

串叶松香草的特性与喂畜效果

串叶松香草,引入山东省定陶县经3年试种获得成功。喂畜试验表明,也取得一定效果。本文介绍了串叶松香草的生物学特性、生长规律和当地的喂畜试验效果。