应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便.为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3'端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库.经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定.结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6%提高至70%,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法.

T7噬菌体表达载体的组氨酸改造及应用

利用基因重组技术,对已有载体T7 Select10-3b进行改造,得到被组氨酸标签标记(His-Tag)的新型表达载体,并利用该载体构建cDNA文库,为后期开放阅读框的筛选提供更为简便有效的方法。以T7 Select10-3b载体为出发材料,将复性得到组氨酸标签表达序列插入其多克隆位点处。再利用包装蛋白包装重组DNA,得到有侵染活性的重组T7噬菌体。用该载体构建乳腺癌cDNA文库,过镍柱,筛选开放阅读框(open reading frame,ORF),计算ORF重组率。测序结果显示该标签已经成功插入,化学发光免疫检测显示该标签在T7中表达。重组T7噬菌体文库的ORF筛选率由筛选前的5.6%提高到82%。T7噬菌体中插入的His标签对提高cDNA文库中ORF的重组率具有重要意义。

非小细胞肺癌预后相关评价标志物的筛选

目的利用生物芯片技术和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者血清及随访结果,筛选出新型NSCLC高敏感性和特异性的血清自身免疫抗体作为分子标志物用于NSCLC的预后评价。方法 (1)提取NSCLC组织总mRNA构建T7噬菌体cDNA文库;(2)用NSCLC预后良好和不良患者血清对T7文库进行生物淘洗;(3)构建蛋白芯片,分别用预后良好和不良患者血清孵育芯片进行Cy5/Cy3双荧光标记并分析芯片结果;(4)对挑选出的标志物进行测序及分析。结果筛选得到最佳评价组合含6个NSCLC预后相关标志物,其联合诊断准确率80.7%,敏感性85.3%,特异性73.9%,AUC为0.825;测序及BLAST分析显示,abl-interactor 1、pleiotrophin、surfactant protein B 3个标志物是已知癌细胞转移和预后相关分子。结论成功筛选得到1个含有6个标志物的最佳评价组合,可对NSCLC预后进行较准确诊断。