制何首乌对CTLA-4抗体诱导的PD-1^(-/-)小鼠肝损伤模型的改善作用

目的探讨制何首乌对CTLA-4抗体诱导PD-1^(-/-)小鼠肝损伤的作用特点及其免疫学机制。方法10只SPF级C57BL/6品系的PD-1^(-/-)小鼠随机分为对照组(n=4)和制何首乌组(n=6)。两组小鼠均于实验前3 d、前1 d及实验开始后每周腹腔注射CTLA-4抗体,同时分别给予0.9%NaCI溶液和何首乌连续灌胃42 d,第43天处死后留血和肝组织,进行生化、病理、免疫组织化学染色及肝组织流式细胞检测。结果制何首乌组小鼠ALT、AST水平较对照组有降低趋势为(43.2±15.5)U/L比(32.8±6.7)U/L和(32.3±7.5)U/L比(23.8±14.1)U/L但差异均无统计学意义(均P>0.05)。对照组小鼠肝脏病理表现为多个大小不等的炎症坏死灶,主要以巨噬细胞和CD4^(+)T细胞浸润为主;而制何首乌组的炎症坏死灶数量显著减少,为121.5(104.0,147.3)比24(17.5,61.5),(P=0.014),肝组织浸润的巨噬细胞、CD4^(+)T细胞数量亦明显减少。流式细胞检测显示,与对照组相比,制何首乌组肝脏内巨噬细胞比例显著降低(2.39±0.77)%比(1.37±0.28)%,(P=0.028),中性粒细胞比例显著降低(0.58±0.11)%比(0.34±0.14)%,(P=0.025),且其分泌的TNF-α比例显著降低(30.15±10.69)%比(11.56±6.05)%,(P=0.012);CD4^(+)T及CD8^(+)T细胞比例虽没有显著变化,但CD4^(+)T细胞活化比例显著降低(26.20±3.47)%比(16.74±6.95)%,(P=0.044),CD8^(+)T细胞分泌颗粒酶B比例显著降低(77.05±4.23)%比(59.70±10.81)%,(P=0.020)。结论制何首乌通过抑制巨噬细胞募集、中性粒细胞和效应性T细胞活化,对CTLA-4抗体诱导PD-1^(-/-)小鼠肝损伤模型起到改善和保护作用。

OX40在D-半乳糖胺/脂多糖诱导的急性肝衰竭中的作用及机制研究

目的研究共刺激分子OX40在D-半乳糖胺/脂多糖诱导的急性肝衰竭中的作用及其相关机制。方法32只C57BL/6小鼠(B6)以及OX40基因敲除(OX40^(^(-/-)))小鼠,采用D-半乳糖胺/脂多糖腹腔注射方式诱导急性肝衰竭,对照组给予等量PBS,随机分成对照组PBS组,实验组D-gal/LPS组和OX40^(-/-)+D-gal/LPS组,监测小鼠存活率、血浆转氨酶以及肝脏病理评估肝损伤程度;流式细胞术检测外周血及肝内淋巴细胞亚群变化,观察免疫细胞的活化以及细胞因子分泌情况。结果急性肝衰竭中,肝组织内CD4 T细胞表达OX40分子明显增高,而CD8和NK细胞表达没有明显变化;OX40敲除后,可显著降低外周血中CD4 T细胞比率并减少其活化,同时也可降低肝组织内CD4 T细胞的活化,减少肝内CD4 T细胞分泌IFN-γ,从而显著减轻小鼠肝脏损伤、提高急性肝衰竭小鼠存活率(OX40^(-/-)+Dgal/LPS组50%vs.D-gal/LPS组20%)。结论在急性肝衰竭中,CD4 T上调OX40表达,促进CD4 T活化及向Th1细胞分化,从而加重急性肝衰竭发生、发展。OX40可以作为急性肝衰竭中适应性免疫活化的重要标志,也可以作为急性肝衰竭的潜在治疗靶点。

肝内T淋巴细胞在急性肝损伤中的作用机制

急性肝损伤（acute liver injury,ALI）是由病毒或细菌感染,毒物摄入,药物服用不当等原因引起的急性肝细胞损伤,临床表现为急性肝功能障碍。若未能及时去除病因或给予适当的药物治疗,急性肝损伤可进展为急性肝衰竭,表现为迅速进展的肝性脑病和多器官功能衰竭,预后差,病死率高。除了原发病因造成的肝细胞损伤外,多种免疫细胞、细胞因子及分子均参与了急性肝损伤的发生与发展。

OX40基因对卵清白蛋白诱导的小鼠哮喘模型的影响机制研究

目的研究OX40基因对卵清白蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型中的影响及其机制。方法选取6~8周龄雄性C57/BL6小鼠20只,应用腹腔注射OVA致敏和雾化吸入OVA的方式诱导野生型和OX40基因敲除小鼠产生过敏性哮喘。通过苏木精-伊红染色、迪夫快速染色、肺气道呼吸阻力测试等方法验证哮喘疾病严重程度。通过流式细胞术检测肺泡灌洗液和肺实质中嗜酸性粒细胞、CD4 T细胞、滤泡辅助T(Tfh)细胞和CD11b^+CD8^-树突状细胞亚群比率。结果OX40基因敲除明显减轻了OVA诱导的小鼠过敏性哮喘的疾病症状和嗜酸性粒细胞在肺部的浸润。与野生型哮喘小鼠相比,OX40基因敲除的哮喘小鼠肺脏中CD4 T细胞和Tfh细胞亚群比率明显降低,CD11b^+CD8^-树突状细胞比率也明显降低。结论OX40基因促进了OVA诱导的小鼠哮喘疾病进程,并显著增高了Tfh细胞和CD11b^+CD8^-树突状细胞比率。

RS4651通过上调SMAD7抑制小鼠肝细胞AML12的EMT作用

目的:研究RS4651对小鼠肝细胞AML12的EMT、细胞增殖以及迁移能力的影响和作用机制。方法:以不同浓度的RS4651干预小鼠AML12细胞,通过Western blot和RT-PCR法检测RS4651各浓度组及空白对照组细胞EMT指标E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达水平。RNA-sequencing确定RS4651的作用通路及互作网络的关键性节点基因。应用SMAD7-siRNA构建SMAD7敲低的AML12细胞模型,细胞分为对照组、RS(60μmol/L)组、SMAD7-siRNA组以及SMAD7-siRNA+RS(60μmol/L)组,应用Western blot和RT-PCR法分别检测各组细胞EMT指标。进一步应用细胞增殖MTS法和Transwell小室迁移法检测各组细胞的增殖和迁移能力,比较各组间差异。结果:RS4651呈浓度依赖性抑制AML12细胞EMT,TGF-β1信号通路中的SMAD7是RS4651发挥作用的关键性节点。敲低SMAD7后,RS4651对AML12细胞EMT、增殖和迁移的抑制作用减弱。结论:RS4651可以通过上调SMAD7抑制小鼠肝细胞EMT、增殖和迁移。

Rag1和Rag2/IL2rγ基因敲除小鼠肝脏缺血再灌注损伤的实验研究

目的 探讨Rag1和Rag2/IL2rγ基因敲除小鼠肝脏缺血再灌注损伤中淋巴细胞对天然免疫细胞的作用.方法 C57BL/6小鼠、Rag1基因敲除小鼠、Rag2/IL2rγ基因双敲除小鼠各10只,每种小鼠按简单随机化分组,分为假手术组和肝脏缺血再灌注损伤组,每组5只小鼠,通过采用小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型,利用流式细胞术检测肝内各种免疫细胞亚群的变化,并观察免疫系统缺陷小鼠,即Rag1基因敲除小鼠和Rag2/IL2rγ基因双敲除小鼠的肝脏缺血再灌注损伤情况及肝脏内细胞亚群的变化.计量资料以均数±标准差((x)±s)表示,数据分析采用独立样本t检验.结果 通过比较假手术组与缺血再灌注组的肝脏内浸润的免疫细胞亚群变化,发现肝脏缺血再灌注后CD4+T细胞、DNT细胞、NK细胞、NKT细胞、库普弗细胞、骨髓来源的巨噬细胞和中性粒细胞的比例均明显升高.Rag1基因敲除小鼠在肝脏缺血再灌注损伤后库普弗细胞、骨髓来源的巨噬细胞和中性粒细胞的比例均比假手术组明显升高;与正常小鼠的肝脏缺血再灌注组相比,血清谷丙转氨酶水平明显下降,从(1 776.25±219.37) U/L下降至(932.33±58.77) U/L(P =0.003,t =7.350),肝脏病理苏木精-伊红染色结果显示坏死区域明显减少.Rag2/L2rγ基因双敲除小鼠在肝脏缺血再灌注损伤后中性粒细胞比例较假手术组依然明显升高,但库普弗细胞和骨髓来源的巨噬细胞的变化并不明显;与Rag1基因敲除小鼠的肝脏缺血再灌注损伤组相比,血清谷丙转氨酶进一步降低,从(932.33±58.77) U/L降至(309.00±163.53) U/L(P=0.002,t=6.182).结论 Ragl和Rag2/IL2rγ基因敲除小鼠肝脏缺血再灌注损伤均较C57 BL/6小鼠轻,T细胞和NK细胞均促进肝脏损伤.其中,T细胞对库普弗细胞、骨髓来源的巨噬细胞和中性粒细胞的募集的影响不大,而对NK细胞的肝脏浸润起到了促进作用;NK细胞可影响库普弗细胞和骨髓来源的巨噬细胞的募集,而对中性粒细胞的影响甚少.

小鼠CD4T细胞转化的双阴性T细胞的效应分子研究

目的研究小鼠CD4T细胞转化的CD4-CD8双阴性T细胞的功能特点，进一步明确双阴性T细胞的免疫抑制作用机制。方法应用转录组测序和蛋白质质谱技术分析了小鼠转化的双阴性T细胞基因表达谱。应用流式细胞术等技术验证了细胞活化分子CD44、CD69和OX40的表达水平并应用CFSE染色法验证双阴性T细胞的杀伤功能。结果小鼠转化的双阴性T细胞表达了与其他成熟CD4T细胞不同的细胞表型。小鼠转化的双阴性T细胞明显高表达细胞表面活化分子CD44、CD69和OX40，以及颗粒酶、穿孔素等细胞杀伤相关基因。穿孔素基因敲除的双阴性T细胞抑制淋巴细胞增殖的能力明显降低。结论小鼠CIMT细胞转化的双阴性T细胞是与其他成熟CD4T细胞不同的T细胞终末分化亚群。小鼠转化的双阴性T细胞高表达细胞活化分子和免疫杀伤类细胞因子，并主要通过穿孔素途径发挥免疫抑制功能。