猪β-干扰素的基因改造表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性测定

本研究根据GenBank上登录的猪β-干扰素基因成熟肽核苷酸序列(mPoIFNβ),在保持原猪β-干扰素蛋白序列不变的基础上,对猪β-干扰素基因进行了毕赤酵母偏嗜性改造,并构建了毕赤酵母重组表达质粒pPICZαC-PoIFNβ。pPICZαC-PoIFNβ经SacⅠ酶切线性化后,电击转化导入感受态的毕赤酵母菌株X-33中,转化子经YPDS+Zeocin抗性平板筛选和PCR鉴定后获得多株阳性菌株。阳性酵母菌株经甲醇诱导分泌表达了重组PoIFNβ,其表达量约为127.9mg/L。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,结果表明,表达产物为分子质量约25和28ku的混合物,并且二者都可与PoIFNβ阳性血清结合。以细胞病变抑制法测定重组β-干扰素在BHK-21细胞上的抗水泡性口炎病毒活性为2.8×103 IU/mL;对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在Marc-145细胞上抗病毒活性达到1.6×103 IU/mL。

一例母猪初乳带毒致仔猪感染PEDV的病例报告

以一例猪场PED发生为案例,通过试验验证,极有可能是乳汁传播PED所导致的。因此,PED的防控应当抓住根源,做好综合防控和监测工作,及时淘汰感染猪只,特别是隐性感染的母猪,防止循环感染。猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种急性高度接触性肠道传染病,以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死性为主要特征。

猪丹毒活菌苗与灭活苗的比较分析

猪丹毒是由猪丹毒丝菌引起的一种急性、热性人兽共患传染病，临床上一般表现为急性败血型、亚急性疹块型，转为慢性型后多表现为心内膜炎、增生性关节炎及皮肤坏死。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病混合感染的诊断与防制

目前在集约化养殖场的猪群中经常出现病毒病和细菌病的混合感染,严重影响中国养猪业的发展。2011年9月,广东某个千头母猪场的猪群大量发病,表现为高热、咳嗽、食欲下降、皮肤发绀、关节肿大等临床症状。通过流行病学调查、剖检、细菌分离鉴定、药敏试验、PCR和RT-PCR等实验室检测最终确诊为高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病和副猪嗜血杆菌病的混合感染,在此基础上提出和实施了该病的防控方案。

抗猪流行性腹泻病毒卵黄抗体的制备及应用

本试验利用猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)SC株免疫产蛋鸡,收集高免卵黄,采用水稀释法和水稀释-盐析法获得鸡源抗PEDV卵黄抗体,采用已建立的ELISA方法对卵黄抗体效价进行测定。以3日龄无母源抗体的易感仔猪为试验动物,对抗PEDV卵黄抗体的治疗效果及安全性进行测定,并进一步利用自然发病猪场的治疗效果进行验证。结果表明,经PEDV SC株细胞毒免疫的鸡可在2次加强免疫后15d产生高水平的特异性抗体。在实验室治疗试验中,攻毒治疗组仔猪的存活率达60%,攻毒对照组存活率为20%;用于自然发病猪场时,饲喂抗PEDV卵黄抗体饲料的仔猪存活率亦为60%,而自然发病对照组的存活率为10%。以上结果表明抗PEDV卵黄抗体对感染PEDV的仔猪有一定治疗作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。

华南地区猪流行性腹泻病毒的分离鉴定及其S基因抗原表位片段的遗传变异分析

应用RT-PCR方法对华南地区某大型猪场疑似猪流行性腹泻病料检测,选取阳性病料接种到Vero细胞,命名为CH/GDGZ/2012(简称GD-12)株。用病毒RNA抽提物为模板,对GD-12的S基因抗原区片段的扩增、克隆后进行核苷酸测序。序列分析表明,CH/GDGZ/2012与CV777、Chinju99、Br1/87、DR13和SM98的核苷酸序列同源性分别为96.9%、93.0%、95.7%、96.7%和96.0%,氨基酸序列的同源性分别为97.7%、91.5%、95.4%、98.0%和94.8%。进化树分析结果显示,华南地区CH/GD-01/2011、CH/GDGZ/2012、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011毒株与经典毒株的遗传距离较大,处于不同的亚群。研究表明,PEDV GD-12株已发生遗传变异、关键抗原表位发生较大变化,该研究可为诊断和防控该病提供参考。

竹鼠巴氏杆菌病的诊治

2008年12月,广东某竹鼠养殖场暴发疾病,200多只竹鼠死亡近100只。经流行病学调查、临床症状、剖检变化、形态学观察、生化鉴定、动物试验和PCR试验,确诊为竹鼠巴氏杆菌病(Pasteurellosis)。药敏试验结果表明,分离株对青霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、先锋Ⅵ等敏感,对卡那霉素、庆大霉素、林可霉素等耐药。使用敏感药物治疗后,疫情得到控制,为竹鼠巴氏杆菌病的防制提供了参考。

副猪嗜血杆菌弱毒疫苗的研制

根据本教研室分离得到的副猪嗜血杆菌,选择毒力强、生长性能和毒力都稳定的菌株作为原始毒株。通过化学诱导剂诱导原始菌株发生突变,再经过毒力试验,挑选出毒力有明显减弱的菌株。安全性试验发现,这些减毒菌株具有较高的安全性,为弱毒疫苗的研制奠定基础。

东山羊巴氏杆菌病的诊治

2008年11月,广东从化某养殖户的羊群中发生一种以咳嗽、呼吸困难、流黏液性鼻液、流产和腹泻为主要特征的疾病。经流行病学调查、临床症状、剖检变化、形态学观察、生化鉴定和动物试验,确诊为东山羊巴氏杆菌病(Pasteurellosis)。药敏试验结果表明,分离株对青霉素、链霉素、先锋Ⅴ、环丙沙星等抗药物敏感,对阿莫西林、四环素、林可霉素等耐药。选用高敏药物治疗,疫情得到了及时控制,为东山羊巴氏杆菌病的防制提供了参考资料。

2012-2014年我国南方地区猪流行性腹泻病毒遗传进化分析

为分析猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,本试验对2012-2014年我国南方地区7个省市17份PEDV阳性样品的S基因主要的中和表位区（COE）序列进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并与国内外的代表性毒株进行序列比对和遗传进化分析,结果表明,本研究中的17株：PEDV毒株COE中有16株属于第1大群,而GD/FSss/2014属于第Ⅱ大群,所有COE的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.9%~99.8%和88.6%~100%,它们与经典毒株CV777的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.3%~99.5%和90%~98.6%,与疫苗株CV777 Vaccine的核苷酸和氨基酸同源性分别为95%~97.1%和92.9%~97.9%。COE的氨基酸序列发生了不同程度的点突变,为PEDV遗传进化分析和疫病防制提供了新的参考。

间接ELISA法测定猪源大肠杆菌外膜蛋白抗体方法的建立

大肠杆菌是条件性致病菌，是引起仔猪黄痢、白痢和成年猪水肿病的重要病原。大肠杆菌病对规模化猪场哺乳仔猪的危害较严重，给养猪业造成了严重经济损失。

猪大肠杆菌融合菌株R2灭活苗的研制及免疫试验

为了研究猪大肠杆菌融合菌株R2蜂胶灭活苗的免疫效果,试验以猪大肠杆菌原生质体融合菌株R2为菌种制备蜂胶灭活苗,采用肌肉注射方式免疫SPF小白鼠,以间接ELISA方法检测血清中IgG抗体水平,同时用2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株与免疫血清做玻片凝集试验,并对小白鼠进行攻毒保护试验。结果表明:该疫苗免疫性能较好,在免疫小白鼠后的第28,35天左右机体内的抗体水平达到最高值,融合菌株R2蜂胶灭活苗可对2种不同血清型的猪大肠杆菌亲本菌株的攻毒试验产生保护,而且安全性能良好,是一种效果较好的菌苗。说明融合菌株R2蜂胶灭活苗作为一种新型疫苗防控猪大肠杆菌病将成为一种可能。

猪胸膜肺炎放线杆菌病的特点

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的猪的一种呼吸道传染病。各种年龄的猪均易感,并常与巴氏杆菌等混合感染。临床上急性以突然发病、肺部纤维性出血为特征;慢性以肺部局部坏死和肺炎为特征。该病在我国的发生呈现逐年上升的趋势,给我国的养猪业造成了严重的经济损失。本文主要从病原特点和流行特征等方面对该病进行综述。

猪流行性腹泻病毒的分离及RT-PCR方法的建立

应用RT-PCR方法对2012年华南地区某大型猪场疑似猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)病料检测,选取阳性病料接种vero细胞,培养至15代,出现明显的细胞病变。为了更好的检测该病毒,根据M基因设计引物,建立了一个快速的RT-PCR方法。

规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断及防治

通过剖检病理变化、细菌分离鉴定、药敏试验和RT-PCR等方法确诊了一例高致病性猪繁殖与呼吸综合征及副猪嗜血杆菌的混合感染,在此基础上提出和实施了相应的防治措施。

表达Omp1和Omp2的猪大肠埃希菌融合菌株R2的构建

为了构建猪大肠埃希菌融合菌株,在药敏试验和MIC试验的基础上,对猪大肠埃希菌HY2株(O101,Omp1)和GXA1株(O107,Omp2)进行交叉耐药培育。以HY2(O101,Omp1,Ami r,Czl s)和GXA1(O107,Omp2,Czl r,Ami s)为亲本菌株,采用溶菌酶-EDTA法制备两亲本菌株原生质体,通过聚乙二醇(PEG)助融,进行原生质体融合,得到3株双耐药融合菌株。结果表明,猪大肠埃希菌原生质体制备和再生的最适条件是:溶菌酶浓度为200U/mL,作用时间为25min。筛选得到3株融合菌株R1、R2、R3,均可凝集两亲本的O抗原,其中,R2凝集性更好更稳定。进一步结合SDS-PAGE分析,显示融合菌株R2能较好的表达两亲本菌株形状,经多次传代仍能够稳定遗传。

3株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF5基因的克隆与序列分析

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种急性接触性传染病,主要引起妊娠母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状,因其具有高致病性和高死亡率,目前该病已成为危害养猪业的病毒性疾病之一[1-3]。PRRSV有2个基因型,分别为美洲基因型（VR2332）和欧洲基因型（LV）,目前我国发现的基因型均与美洲基因型的亲缘性接近[4]。

传染性胃肠炎病毒PY-D株的分离鉴定及其S基因B、C抗原位点的克隆与序列分析

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的、猪的一种急性、高度接触性传染病，具有高致病性、高死亡率的特点，不同年龄和品种的猪对该病均易感，表现为呕吐、严重腹泻和脱水等临床特征，且该病在世界范围内广泛分布，我国从20世纪50年代末期就有该病的报道，近年来TGE在我国部分地区时有发生和流行，给养猪业造成了极大的危害。对该病的有效监测是预防该病的方法之一，而其中以病毒分离鉴定、抗体监测为主要内容。

一株类禽H1N1亚型猪流感病毒的进化研究

为了解猪流感病毒(SIV)的变异情况,2013年1月份从山西某养殖场采集呈流感症状的猪鼻拭子10份,采用常规方法接种10日龄SPF鸡胚,进行RT-PCR鉴定及全基因序列分析。结果表明:分离到1株类禽H1N1亚型猪流感病毒,命名为A/swine/Shanxi/02/2013(H1N1);全基因序列测定及同源性分析发现,8个基因片段均与2011年江苏地区流行的类禽型H1N1亚型猪流感病毒有较高的同源性;系统遗传演化发现,该病毒株是由2011年类禽型H1N1流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(H1N1)进化而来的;HA1氨基酸位点差异分析发现,该病毒株与2009年人群中流行的甲型H1N1流感和经典H1N1毒株抗原性差异较大,其HA裂解位点基序为PSIQSRGLF,呈低致病性特征。