木栓酮合酶TwOSC1的产物异构化研究

来源于雷公藤的木栓酮合酶TwOSC1能够催化(3S)-2,3-氧化鲨烯生成木栓酮、α-香树脂醇和β-香树脂醇,三者比例为3:1:1。将TwOSC1引入酿酒酵母能够合成木栓酮,但产量较低,无法达到工业化生产的需求,TwOSC1催化活性低,产物专一性差是影响其产量的主要瓶颈。通过理性和半理性设计分析TwOSC1的关键氨基酸残基位点,利用蛋白质工程对关键氨基酸残基(N11、G280、I259、I548、M552)进行改造。研究结果表明,突变体N11I、N11A、N11W、N11R、N11F、I548W、I548L的木栓酮产量降低;突变体G280H、G280P、G280S、M552S的木栓酮产量提高,且TwOSC1G280H催化活性最好,是野生型TwOSC1产量的1.27倍;突变体I259A、I259E、I259K、I259M、I259R无催化活性,但突变体TwOSC1I259E合成α-香树脂醇的专一性较高,是野生型TwOSC1产量的5倍。研究初步探索了5个关键氨基酸残基位点对TwOSC1催化活性及产物专一性的影响,为后续深入探究TwOSC1关键氨基酸位点提供了有价值的参考。

α-11贾第素相互作用蛋白鉴定与验证

目的 鉴定并验证α-11贾第素的相互作用蛋白,为其功能研究提供实验依据。方法 构建C2株蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和α-11贾第素诱饵质粒,通过酵母双杂交筛选出可能与α-11贾第素相互作用的蛋白。将α-11贾第素和筛选出的可能互作蛋白基因分别构建入pBiFc-Vc-155、pBiFc-Vn-173质粒,共转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescent complementation,BiFC)实验验证两种蛋白的相互作用。结果 构建了库容为2.715×10~7细菌菌落总数(CFU)的蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交cDNA文库和含有α-11贾第素基因的无自激活活性的诱饵质粒。通过酵母双杂交两轮阳性筛选,共筛选出6个可能与α-11贾第素相互作用的蛋白,分别为真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,EIF5A)、钙调蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase,CAMKL)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸特异性谷氨酸脱氢酶(NADP-specific glutamate dehydrogenase,NADP-GDH)、假设蛋白1(GL50803_95880)、假设蛋白2(GL50803_87261)和一段来自犬贾第虫病毒的蛋白。成功将α-11贾第素基因与EIF5A基因分别转入BiFc系统质粒p BiFc-Vc-155与pBiFc-Vn-173,将矫正突变的pBiFc-Vc-155-α-11与pBiFc-Vn-173-EIF5A重组质粒共转染MDA-MB-231细胞后,镜下观察可见绿色荧光,证实α-11贾第素与EIF5A蛋白在细胞内存在相互作用。结论 成功构建了C2株蓝氏贾第鞭毛虫酵母双杂交文库,并鉴定出6个α-11贾第素可能的相互作用蛋白,其中EIF5A与α-11贾第素在细胞内存在相互作用。

酿酒酵母合成木栓酮及其衍生物的研究现状及展望

木栓酮及其衍生物在植物中普遍存在且种类繁多,具有丰富的生理药理学活性。木栓酮衍生物是以木栓酮为骨架经细胞色素氧化酶P450(cytochrome P450,CYP450)及UDP葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)修饰而来。植物中天然木栓酮及其衍生物的含量极低,传统的萃取分离和化学合成效率低、能耗高且污染环境,因此,利用酿酒酵母作为宿主菌生产木栓酮及其衍生物是一种高效且环保的策略。本文从增加前体含量、提高酶活性和产物合成的亚细胞定位等方面介绍并展望了木栓酮在酿酒酵母中高效生产的策略,并介绍了目前几种常见的木栓酮衍生物研究现状,从根据碳骨架相似性挖掘CYP450、蛋白质工程改造CYP450和合成代谢基因簇的挖掘等方面展望了木栓酮衍生物的合成途径解析的新思路。

中性粒细胞胞外诱捕网在抗寄生虫免疫中的作用研究进展

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是活化的炎性中性粒细胞在感染或炎症应答期主动释放的一种串珠样纤维网状物质,由染色质DNA和多种胞内蛋白成分组成,可通过缠绕致病菌限制其扩散,同时通过各种抗菌蛋白杀伤致病菌,被认为是中性粒细胞除吞噬和脱颗粒作用外的第三种杀菌机制。近年研究显示,NETs也参与抗寄生虫免疫过程。本文就NETs在抗寄生虫免疫中作用的研究进展作一综述,以期为寄生虫病发病机制研究以及相关治疗药物开发提供参考。