一种经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体在CAR-T细胞中的应用

本研究将microRNA插入EF1α启动子的内含子中,构建携带沉默PD-1基因的miRNA的新型慢病毒载体,并将其应用于CAR-T细胞。通过流式细胞术检测慢病毒载体转导效率和PD-1沉默效率;Westernblotting检测PD-1蛋白表达差异;荧光定量PCR检测microRNA相对表达情况;荧光素酶生物发光法和流式细胞术检测CAR-T细胞的能力。结果显示与U6转录microRNA的载体相比较,将microRNA插入到EF1-α内含子中的病毒载体转导效率更显著,对PD-1的敲低效率均达90%以上,且Westernblotting结果验证了PD-1的敲低效果。另外通过荧光定量PCR,可显示出转导该新型慢病毒载体的Jurkat细胞内microRNA的相对表达量。荧光素酶生物发光法证实了CAR-T细胞针对靶细胞的特异杀伤性,流式细胞术结果表明沉默PD-1的CAR-T细胞相较于正常CAR-T细胞显示出更强的特异性杀伤能力。本研究成功构建了经microRNA敲低PD-1的新型慢病毒载体并验证了其转导效率的优越性,以及基于此载体表达的microRNA可高效地沉默PD-1;且应用此载体的CAR-T细胞能发挥更强的杀伤活性,从而为后续该CAR-T细胞治疗表达PD-L1的肿瘤奠定基础。

靶向CS1的第四代嵌合抗原受体T细胞治疗难治或复发性多发性骨髓瘤的初步研究

目的分析在第二代嵌合抗原受体(CAR)的基础上设计的同时分泌白细胞介素7(IL7)和趋化因子19(CCL19)的第四代嵌合抗原受体T细胞(CAR-T),在多发性骨髓瘤微环境中增殖、趋化、清除肿瘤细胞和持久性等方面的能力。方法通过2A自剪切肽技术构建第四代CAR载体质粒,采用第三代慢病毒包装系统制备高滴度慢病毒,通过流式细胞术检测慢病毒转导效率和CAR-T细胞亚型的变化;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CAR-T细胞中IL7和CCL19的分泌情况;手工计数法分析CAR-T细胞在培养过程中的增殖活性;Transwell迁移实验验证CAR-T细胞趋化能力;荧光素酶生物发光法检测CAR-T细胞特异性杀伤活性;小鼠异体移植模型验证CAR-T细胞体内抗骨髓瘤活性和安全性。结果流式细胞术结果显示,抗CS1 CAR-T和抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞CAR的表达率分别为(91.50±0.29)%和(46.70±0.12)%,表明CAR-T细胞构建成功。亚型分析显示,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞中T记忆干细胞(TSCM)的比例为(67.58±0.59)%,高于抗CS1 CAR-T[(50.74±1.01)%,P=0.000 1],具有更强的免疫记忆功能,持久性更佳。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞较对照组(MOCK-T)和抗CS1 CAR-T组能够持续分泌IL7和CCL19(P<0.000 1)。抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在慢病毒转导后的第9天细胞数达到(22.77±0.79)×106个,高于抗CS1 CAR-T细胞[(9.40±0.79)×106个,P=0.000 1],具有更强的增殖能力。Transwell迁移实验中,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞对于反应T细胞的趋化细胞数为(109.00±4.04)个/视野,高于对照组和抗CS1 CAR-T组[分别为(9.33±1.20)个/视野和(7.33±0.88)个/视野,均P<0.000 1],具有更强的趋化能力。杀伤实验结果显示,与对照组细胞比较,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T和抗CS1 CAR-T均具有特异性的杀伤效能(P<0.000 1)。动物实验表明,抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞降低了荷瘤小鼠的肿瘤负担(P<0.000 1),并延长了总生存时间(P=0.006 1)。结论第四代抗CS1-IL7-CCL19 CAR-T细胞在不影响体内外抗骨髓瘤活性的情况下,有着更强的增殖活性、趋化能力和持久性,为克服传统CAR-T细胞存活率低下、持久性差以及受肿瘤微环境抑制等缺陷提供了策略,为第四代CAR-T细胞的临床应用提供了前期实验依据。