SH3BP4基因对肝癌细胞迁移和增殖作用的实验研究

目的:构建SH3结构域结合蛋白4(SH3-domain binding protein 4,SH3BP4)重组腺病毒载体及shSH3BP4慢病毒载体,初步探索SH3BP4对肝癌细胞迁移增殖能力的影响。方法:PCR扩增SH3BP4 cDNA序列并构建腺病毒重组质粒pAdEasySH3BP4,HEK293细胞包装重组腺病毒AdSH3BP4;构建SH3BP4基因短发夹型RNA干扰慢病毒载体,转染至HEK293T细胞,包装重组慢病毒shSH3BP4。采用Western blot检测SH3BP4在人正常肝脏细胞及肝癌细胞的内源性表达,将SH3BP4过表达实验部分设为3个组:Mock组、AdGFP组和AdSH3BP4组,Mock组为空白对照组,AdGFP组为感染腺病毒AdGFP的对照组,AdSH3BP4组为感染腺病毒AdSH3BP4的实验组;将SH3BP4敲低实验部分设为2个组:sh Control组和shSH3BP4组,sh Control组为感染慢病毒sh PLL3.7的对照组,shSH3BP4组为感染慢病毒shSH3BP4的实验组。通过Transwell和划痕实验检测SH3BP4过表达和敲低对肝癌细胞迁移能力的影响;MTS和直接克隆形成实验检测SH3BP4过表达和敲低对肝癌细胞的增殖能力的影响。结果:经限制性内切酶酶切及DNA测序验证,成功构建AdSH3BP4重组腺病毒载体和shSH3BP4慢病毒载体。Transwell结果表明,AdSH3BP4组(74.800±0.544)相较于空白对照组(219.467±2.640)与AdGFP组(210.533±8.498),迁移的细胞数明显减少(P=0.000);而shSH3BP4组(191.467±3.906))比sh Control组(91.733±2.763)细胞的迁移数目明显增加(P=0.000)。划痕实验结果表明,AdSH3BP4组的细胞修复率[(10.400±0.036)%]明显低于空白对照组[(37.500±0.063)%]与AdGFP组[(50.000±0.063)%](P=0.000);而shSH3BP4组[(55.00±0.05)%]明显高于sh Control组[(23.3±0.029)%](P=0.000)。MTS结果表明:AdSH3BP4组在96 h的吸光度值(0.921±0.053)与空白对照组(1.091±0.043)及AdGFP组(1.062±0.024)相比明显降低(P=0.005)。shSH3BP4组在96 h的吸光度值(1.497±0.020)与sh Control对照组(1.142±0.103)相比明显升高(P=0.004)。直接克隆形成实验结果表明,AdSH3BP4组的细胞克隆形成数(34.333±2.082)相较于空白对照组(86.333±4.726)与AdGFP组(87.333±1.528)明显减少(P=0.000),而shSH3BP4组(65.000±6.557)却明显高于sh Control组(31.000±2.000)(P=0.001)。上述实验结果说明SH3BP4过表达能显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力,而SH3BP4敲低能明显促进肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。结论:SH3BP4可抑制肝癌细胞迁移、侵袭和增殖,可能为肝癌的诊治提供一个新的靶标。

果糖-1,6-二磷酸酶1抑制肝癌细胞株HepG2的自噬及增殖

目的构建果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)重组腺病毒,并探究FBP1对肝癌细胞(HepG2)自噬及增殖的影响。方法PCR扩增FBP1cDNA序列并克隆到腺病毒载体pAdTrack-TO4,构建重组腺病毒质粒pAdTrack-FBP1,将重组腺病毒质粒用Lipofectamine3000转染至HEK293细胞中,包装、扩增获得高滴度重组腺病毒AdFBP1。用重组腺病毒AdFBP1感染HepG2细胞,同时设置Mock组和AdGFP组。通过Westernblot技术和激光共聚焦技术观察FBP1对肝癌细胞自噬水平的影响,进一步通过克隆形成实验和MTS实验观察FBP1对肝癌细胞增殖能力的影响。组间均数比较采用t检验、单因素方差分析。结果成功构建高滴度重组腺病毒FBP1。Westernblot和激光共聚焦检测结果显示,与AdGFP组相比,AdFBP1组自噬水平明显降低。Westernblot结果表明,AdGFP组的LC3Ⅱ蛋白相对表达水平为1.10±0.10,AdFBP1组的为0.30±0.01,F=90.36,P<0.01。激光共聚焦结果表明,AdGFP组肝癌细胞的平均自噬体数量为(28.33±1.53)个,AdFBP1组的为(12.33±1.53)个,F=97.40,P<0.01。另外,克隆形成实验和MTS实验结果显示,与AdGFP组相比,AdFBP1组肝癌细胞的增殖明显受到抑制。克隆形成实验结果表明,AdGFP组的细胞克隆为(65.66±2.57)个,AdFBP1组的细胞克隆为(34.00±2.00)个,F=141.50,P<0.01。MTS实验结果表明,AdGFP组96h的吸光度值为39.13±2.21,AdFBP1组在96h的吸光度值为30.61±3.33,F=7.80,P<0.05。结论FBP1抑制肝癌细胞HepG2的自噬及增殖。