TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞杀伤的体外实验研究

目的:探讨脂质体介导的TK/GCV系统对骨肉瘤MG-63细胞的杀伤作用以及所产生的旁观者效应。方法:脂质体介导TK基因体外转染骨肉瘤MG-63细胞,倒置荧光显微镜观察细胞转染是否成功,流式细胞仪检测转染细胞与未转染细胞的转染效率。将未转染的骨肉瘤MG-63细胞分为3组,实验1组用转染TK/GCV的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;实验2组用0.22μm滤器过滤的转染后的细胞上清液与原培养液按1/10、1/7、1/5、1/2比例混和液培养;对照组用培养液培养,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别测定各组细胞的生长抑制率及骨肉瘤细胞对TK/GCV系统的敏感性。结果:经TK基因转染的MG-63细胞,倒置荧光显微镜下有大量绿色荧光蛋白表达,流式细胞仪检测转染TK基因的细胞转染效率可达75.5%。6 d后MTT检测结果显示实验1组中各比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比有统计学意义(P<0.05);实验2组中1/10、1/7比例浓度的混合培养液对细胞的抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。经TK基因转染的MG-63细胞随GCV浓度增加,细胞凋亡率增加。结论:脂质体介导的TK/GCV系统能够通过旁观者效应抑制骨肉瘤MG-63细胞的生长。

LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达。方法:利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经AgeⅠ酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定。经293T细胞包装后,收集富含病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定。以最佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Western blot检测转染细胞LMP-1基因的表达。结果:①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2×108TU/ml的LV-LMP-1-EGFP。②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93.5%,经RT-PCR与Western blot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达。结论:成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因。

Companacci分期以及术式对骨巨细胞瘤治疗效果的影响

目的探讨骨巨细胞瘤的X线Campanacci分期以及术式对骨巨细胞瘤手术治疗效果的影响。方法回顾性分析2002年12月～2012年2月本院收治的120例骨巨细胞瘤患者的临床资料,其中,刮除组75例,切除组45例。按X线Campanacci分期Ⅰ期25例,主要术式:刮除术、瘤体切除、瘤体切除人工假体置换、截趾术;Ⅱ期60例,主要术式:病灶刮除术、瘤体切除、瘤段切除铰链膝关节置换术、瘤体切除植骨;Ⅲ期35例,主要术式:病灶刮除、瘤体切除、瘤体切除植骨、瘤段切除人工假体置换、瘤段切除铰链膝关节置换术、截肢术。结果刮除组术后总的复发率为9.3%,高于切除组总的复发率为4.4%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05),刮除组的预后比切出组好,差异有统计学意义(P<0.05)。CampanacciⅠ、Ⅱ、Ⅲ期术后的复发率依次为20.0%、5.0%、2.9%;受限率依次为24.0%、6.7%、22.9%。Ⅰ期的术后复发率明显的高于Ⅱ、Ⅲ期,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅱ、Ⅲ期差异无统计学意义(P>0.05);Ⅰ期受限率高于Ⅱ期,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅱ期受限率低于Ⅲ期,差异有统计学意义(P<0.05),Ⅰ期与Ⅲ期差异无统计学意义(P>0.05)。结论就单纯的切除组或刮除组而言,随着Campanacci分期增高,其复发率是增高的。但是侵袭性高的骨巨细胞瘤选择切除术治疗甚至要优于选择刮除治疗侵袭性低的骨巨细胞瘤。Campanacci分期能够很好的指导临床手术方式的选择,手术方式的选择对骨巨细胞瘤的治疗、预后、复发起着至关重要的作用。

不同髋部骨折之间Singh指数的差异性分析

目的探讨骨密度测定、Singh指数两种不同检查方法评估骨质疏松程度的相关性,了解不同髋部骨折之间Singh指数的差异性,为基层医院筛查高危人群提供简便廉价的方法。方法统计因轻微外伤所致股骨颈骨折、粗隆间骨折的患者各100例,调取骨盆正位片,并按Singh指数分类法统计股骨近端骨小梁级数,运用统计学方法比较股骨颈骨折、粗隆间骨折Singh指数的差异性。结果股骨颈骨折患者Singh指数为(3.73±1.100),粗隆间骨折患者Singh指数为(3.27±1.286),两组应用独立样本t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用X线片评定股骨近端骨小梁结构变化对于预测髋部骨折的危险性具有一定价值。

全反式维甲酸联合TK基因治疗对骨肉瘤旁观者效应的研究

目的观察全反式维甲酸(ATRA)联合脂质体介导的自杀基因/丙氧鸟苷(TK/GCV)系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应的影响。方法重组质粒plRES-EGFP-TK培养和转染人骨肉瘤U-2细胞,荧光倒置显微镜和流式细胞仪观察转染后的细胞生长状态,MTT法检测plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤力。ELISA检测细胞培养液中连接蛋白(CX)43的表达情况。结果 plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞旁观者效应在TK+∶TK-细胞比例为5∶5时明显出现(P<0.05),而联合ATRA后,在TK+∶TK-细胞比例为3∶7时明显出现(P<0.05),且在细胞生存率均在50%时,TK+细胞比例下降20%。ATRA(10-6mol/L)处理人骨肉瘤U-2细胞24h、48h、72h后,CX43蛋白的浓度分别为(0.559±0.018)ng/mL、(0.654±0.023)ng/mL、(0.826±0.065)ng/mL,均P<0.01。结论全反式维甲酸可能通过增强CX43的表达,提高plRES-EGFP-TK/GCV系统对人骨肉瘤U-2细胞的杀伤效应。

益气润肺汤联合穴位贴敷治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的临床效果

目的探讨益气润肺汤联合穴位贴敷治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)的临床效果。方法选取2019年5月至2021年5月南阳市第一人民医院收治的120例AECOPD患者作为研究对象,采用随机数表法分为对照组和观察组,各60例。对照组在常规治疗的基础上接受穴位贴敷疗法,观察组在对照组的基础上接受益气润肺汤联合穴位敷贴治疗。比较两组治疗1个疗程的临床效果;比较两组治疗前、治疗1个疗程时的肺功能参数、血气分析指标;比较两组不良反应发生情况。结果治疗1个疗程,观察组临床总有效率高于对照组(P<0.05);治疗1个疗程,两组AECOPD患者的肺功能参数水平高于治疗前,且观察组高于对照组(P<0.05);治疗1个疗程,观察组AECOPD患者的PaO_(2)和SaO_(2)水平高于对照组,PaCO_(2)水平低于对照组(P<0.05);治疗期间,两组AECOPD患者均未发生明显不良反应。结论益气润肺汤联合穴位贴敷可改善AECOPD患者肺通气功能和血气分析指标,能有效缓解症状,临床效果良好。

四花穴麦粒灸结合疏肝泻火汤治疗气郁化火型中风后抑郁临床研究

目的:观察四花穴麦粒灸结合疏肝泻火汤治疗气郁化火型中风后抑郁的临床疗效。方法:将96例中风后抑郁患者按照随机数字表法分为对照组和观察组,每组各48例。对照组给予氟西汀治疗,观察组在对照组治疗的基础上给予四花穴麦粒灸结合疏肝泻火汤治疗。比较两组患者治疗前后中医证候积分、神经功能[血清5-羟色胺(5-hydroxy tryptamin,5-HT)、S100-β、美国国立卫生院神经功能缺损评分(national institutes of health neurological deficit score,NIH-SS)]、抑郁及日常生活状态[汉密尔顿焦虑量表(hamilton depression scale,HAMD)评分、日常生活活动能力量表(activity of daily living,ADL)评分]及不良反应发生情况。结果:两组患者治疗后口角歪斜、胸胁胀满、头晕耳鸣及舌红苔黄评分低于本组治疗前,且治疗后观察组低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗后5-HT高于本组治疗前,S100-β、NIHSS评分低于本组治疗前,观察组治疗后5-HT高于对照组,S100-β、NIHSS评分低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组患者治疗后ADL评分高于本组治疗前,HAMD评分低于本组治疗前,观察组治疗后ADL评分高于对照组,HAMD评分低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组患者不良反应发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:四花穴麦粒灸结合疏肝泻火汤治疗气郁化火型中风后抑郁,可改善患者神经功能、抑郁状态,提高日常生活能力。

穿刺针作为线锯引导器在胸腰椎肿瘤全脊椎整块切除术中的应用

目的探讨应用经皮椎体成形穿刺针作为线锯引导器在胸腰椎肿瘤一期后路全脊椎整块切除术中的可操作性和安全性。方法收集并回顾性分析2017年6月至2018年3月接受一期后路全脊椎整块切除术式治疗的胸腰椎肿瘤患者4例，男2例，女2例，年龄50-77岁，平均63．75岁。Tomita5型T7原发弥漫大B细胞淋巴瘤1例，Tomita3型T5肺癌骨转移1例，Tomita5型T9前列腺癌骨转移1例，Tomita4型L2肾癌骨转移1例。利用经皮椎体成形穿刺针结合改良的“两侧锯割、中间切断”三步法椎间盘截断技术对4例胸腰椎恶性肿瘤行一期后路全脊椎整块切除术，记录手术时间、术中出血量，观察病椎切除的完整性、术后并发症，术前术后进行疼痛视觉模拟评分（visual analogue score，VAS）评估患者疼痛改善情况，采用美同脊柱损伤协会（American Spinal Injury Association，ASIA）神经功能分级评估胸椎肿瘤患者神经功能的改善情况，对受累肌群行肌力分级以评估腰椎肿瘤患者神经功能的改善情况。结果4例病椎均获得两部分整块切除，手术时间4．0-6．5h，平均4．9h，术中出血量800-9000ml，平均3200ml。术中未发生硬脊膜撕裂、脑脊液漏、医源性脊髓损伤和大血管损伤，术中线锯切割平面牢固定位于椎间盘层面，没有发生切割平面的滑移。术后4例患者疼痛较术前都明显缓解，VAS评分由术前平均7．5分（6-9分）降低至术后平均1．75分（1-2分），平均降低5．75分（5-7分）。术后神经症状均未加重，并且3例患者ASIA分级或肌力分级较术前均提高1级，其中2例胸椎肿瘤病例ASIA分级由术前B级改善至术后C级，1例腰椎肿瘤病例受累肌群肌力由术前3级改善至术后4级。术后随访3．5-12个月，平均8．1个月，均无局部复发，1例肺癌骨转移患者出现间断性肋间神经痛。结论采用经皮椎体成形穿刺针作为线锯引导器，无论在截断椎弓根时，还是改良三步法截断椎间盘时，均有良好的可操作性和安全性。

TK基因转染骨肉瘤U-2细胞体外实验研究

目的研究脂质体介导的TK/GCV系统对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其产生的旁观者效应。方法构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,制备和转化感受态大肠杆菌BL21以及鉴定测序,提取、纯化重组质粒DNA,培养和转染人骨肉瘤细胞株U-2 OS,流式细胞仪分析和荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态,用转染后的培养液的上清加入TK(-)U-2 OS中观察旁观者效应。结果成功地构建出包含有TK基因cDNA片段的重组质粒pIRES-EGFP-tk,通过PCR等方法鉴定质粒大小和位点均符合实验设计。荧光显微镜下观察U-2 OS(TK+)呈现绿色荧光。U-2 OS TK/GCV培养上清液可明显诱导细胞凋亡。但将上清液用0.2μm的滤膜滤过后,诱导凋亡作用消失。结论成功构建重组质粒pIRES-EGFP-tk,体外实验表明人骨肉瘤细胞系U-2 OS对脂质体介导的TK/GCV系统敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径。