盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

【目的】盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强。PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用。构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义。【方法】利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N。【结果】通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功。制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功。【结论】成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达。

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca^(2+)而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有。研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础。[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一。实验利用RT-PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SdI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12-5N。[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功。制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功。[结论]成功构建了玉米ZmCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母。

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

【目的】以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体。【方法】采用PCR方法和基因枪法。【结果】用PCR法,以pGEM-T-HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段。然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S-GFP-HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达。采用基因枪法将35S-GFP-HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位。【结论】构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础。

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。