我国斑点热立克次体新种检测及其rOmpA基因序列分析

采用斑点热群立克次体特异引物扩增福建南部来源蜱标本和动物标本中的DNA ,以发现我国可能存在的新种斑点热群立克次体。以立氏立克次体rOmpA基因序列中的相关序列为引物 ,扩增标本中rOmpA基因部分片段 ,用pGEM -T载体及其宿主菌进行阳性克隆筛选 ,阳性克隆经鉴定之后提取质粒DNA ,进行序列测定。测定序列用Blast软件进行序列同源性比较并采集相关序列 ,用Bootstrip方法随机取样 10 0次 ,用PHYLIP软件包进行聚类分析。共检测采自福建宁化地区的越原血蜱 10 0只和野鼠类血标本 38份。其中从越原血蜱(不同来源 )扩增出斑点热立克次体基因片段 ,阳性率为15 0 4% ( 17/ 113) ;并从社鼠、黄胸鼠、褐家鼠扩增出阳性片段 ,以鼠类为单位计算其阳性率为 44 73%。对寄生于野鼠的越原血蜱扩增的阳性片段序列分析表明新测序列与其它斑点热群立克次体的同一基因片段不同 ,其与日本立克次体同源性最高 ,核苷酸序列同源性为 94% ,推定的氨基酸序列同源性为89 %。从病原学角度首次证实我国福建省存在日本立克次体近缘种立克次体 。

我国部分地区蜱传斑点热分子流行病学调查研究

目的为进一步了解我国斑点热群立克次体存在的多样性,发现可能存在的斑点热群立克次体新成员、潜在媒介和动物宿主。方法建立了扩增斑点热群立克次体190kDa rOmpA基因片段的PCR检测、鉴定方法,并用此方法检测了采自福建省和内蒙古自治区的蜱、动物和人血液标本。对扩增于越原血蜱、森林革蜱和FNH97未鉴定菌株的PCR产物采用PHYLIP软件包进行了序列分析。同时,为了寻找特异的斑点热群立克次体分类检测方法,建立了针对四种斑点热群立克次体的半巢式PCR方法,并对斑点热立克次体阳性标本进行了分类检测。结果采用 190kDa rOmpA.701/70p引物可以从7株斑点热群立克次体中的6株扩增出外膜蛋白A基因片段(小蛛立克次体除外)。并从采自福建省和内蒙古自治区的多种蜱及野生动物、人血液标本中扩增出了斑点热立克次体DNA片段,其中越原血蜱、卵形硬蜱、中华硬蜱、豪猪血蜱、森林革蜱、野鼠血块和人群血块的阳性率分别为15.69％、56.94％、8.70％、7.70％、43.56％、82.51％和0.98％。对来自越原血蜱和森林革蜱以及FNH97菌株的斑点热立克次体190kDa外膜蛋白A630bp左右核苷酸片段序列分析和推测的氨基酸序列分析结果表明:福建越原血蜱立克次体(福建立克次体)核苷酸序列与日本立克次体的该序列同源性最高(94％)。推测氨基酸序列同源性也与该立克次体最高(89％);内蒙古森林革蜱立克次体(森林革蜱立克次体)核苷酸序列与扇头蜱立克次的该序列同源性最高(97％),推测氨基酸序列的同源性也最高(95％)。遗传发育分析,这两种立克次体分别与日本立克次体和扇头蜱立克次体均为同一个分支。序列中限制性核酸内切酶的位点也显示了对应的相似性。但是它们的核苷酸和推测的氨基酸序列与康氏立克次体和西伯利亚立克次体以及内蒙古立克次体(HA-91)差别较大。提示,这两种蜱携带的立克次体可能是我国尚未发现的斑点热群立克欢体新成员。用初步分类引物对蜱标本、血液标本检测结果显示:以“福建立克次体”序列设计的引物检测越原血蜱阳性率为8.49％,卵形硬蜱阳性率为20.83％,中华硬蜱阳性率为4.35％,豪猪血蜱为阴性;以西伯利亚立克次体序列设计的引物检测卵形硬蜱阳性率为 24.39％,越原血蜱阳性率为 5.56％,中华硬蜱和豪猪血蜱均为阴性。以内蒙革蜱立克次体序列设计的引物扩增森林革蜱阳性率为43.56％。结论通过本次研究,在以下方面获得了新的认识:越原血蜱、卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱是福建南方蜱传斑点热立克次体的媒介或潜在媒介,其中卵形硬蜱、豪猪血蜱和中华硬蜱为我国首次证实的携带斑点热立克次体;福建的越原血蜱和内蒙古的森林革蜱分别携带一种未知斑点热群立克次体,并分别与日本立克次体和肩头蜱立克次体近缘;取自斑点热立克次体rOmpA基因的引物用于PCR,作为一种快速简便手段可直接用于斑点热立克次体初步分类和分子流行病学调查;我国可能存在斑点热群立克次体的多个成员及其自然疫源地。

一种新螺旋体病原学的初步研究

一种新螺旋体病原学的初步研究北京军事医学科学院微生物流行病研究所（北京１０００７１）张泮河，张启恩，代晓红，曹军田，张习坦１９９３年至１９９４年我们先后从西藏错那地区的人、野鼠和蜱体内分离到多株螺旋体［１］，取其中一株螺旋体（１９９４年从错那地区的西...

检测莱姆病McAb-ELISA竞争法的建立及初步应用

用自制的莱姆病单克隆抗体VLG2 F9株,建立了检测血清中莱姆病抗体的ELISA非限制性竞争法。用超声波粉碎、高速离心相结合制备可溶性抗原;用羟基磷灰石层析法对单克隆抗体进行纯化均获得了满意结果。实验结果表明,ELISA竞争法特异性高、稳定性和可重复性好,操作简便,可用于不同种动物血清的检测,用该方法检测92份人血清阳性率22.8％,同时测定101份牛血清阳性率为69.9％,该法用于莱姆病的实验诊断尚属首次。该法的建立对莱姆病实验诊断的标准化以及流行病学调查具有重要的实际意义。

我国莱姆病病原研究和诊断方法的进展

我国莱姆病病原研究和诊断方法的进展中国军事医学科学院（北京１０００７１）张泮河（综述）张启恩（审阅）莱姆病是由伯氏疏螺旋体引起的一种经蜱传播的多系统受累的疾病。我国１９８６年首次在黑龙江省海林地区发现莱姆病［１］，１９８７年分离到病原体，并对其宿主动...

吉林省林区蜱粒细胞无形体感染的调查

目的调查吉林省蜱粒细胞无形体感染。方法运用聚合酶链反应方法对吉林延边地区采集的蜱标本粒细胞无形体16S rRNA和gltA基因片段进行扩增及序列分析,将扩增序列与GenBank注册的基因序列进行比较,构建粒细胞无形体gltA基因进化树。结果共检测游离蜱427只,其中全沟硬蜱100只,森林革蜱327只,粒细胞无形体感染阳性率分别为4.00%和0.00%。寄生蜱感染阳性率2.9%。寄生蜱与游离蜱感染率差别无显著性。16S rRNA序列与我国已在GenBank注册的AF205140序列一致,与国外粒细胞无形体16S rRNA序列存在不同程度的差异,相似性为97%～99%;gltA基因与GenBank的粒细胞无形体gltA基因片段比较,相似性为87%～97%,推导的氨基酸序列相似性为84%～99%。结论我国吉林省林区存在蜱粒细胞无形体感染。

森林革蜱、草原革蜱感染和经期传播莱姆病螺旋体的实验研究

以实验室培育的非感染森林革蜱Dermacentorsilvarum、草原革蜱D .nuttalli刺叮人工感染 2 1天后的阳性KM鼠 ,利用分离培养和PCR方法检测蜱对螺旋体的保持能力以及体内螺旋体对敏感动物的感染能力。结果如下 :非感染幼蜱均可以通过吸血获得莱姆病螺旋体 ,饱血森林革蜱和草原革蜱幼蜱PCR阳性率均为 5 0 0 %而分离阳性率都为 2 0 0 %。饱血脱落后 ,这些幼蜱只能在饱血后 2天内分离到莱姆病螺旋体。PCR检测阳性也只能持续到 4天 ,均不能跨越蜕皮阶段。蜕化为若蜱后 ,若蜱以及分别受到这些若蜱刺叮的KM鼠均未发现阳性感染。非感染若蜱吸食感染的KM鼠后 ,饱血森林革蜱和草原革蜱获得了莱姆病螺旋体 ,PCR检测阳性率分别为 5 0 0 %和 2 0 0 %。分离阳性率分别达到 33 3%和 6 0 0 %。这些若蜱分别于饱血后 2天和 3天可以分离到莱姆病螺旋体 ,PCR扩增阳性也只能分别持续到饱血后 4天和 6天 ,均不能跨越蜕皮阶段 ;蜕化为成蜱后 ,成蜱以及受到它们攻击的KM鼠均未获阳性检测结果。同种蜱不同地理株在感染和保持莱姆病螺旋体的能力上也没有差异。森林革蜱、草原革蜱的幼蜱和若蜱虽可以吸血感染但均不具备经期传播莱姆病螺旋体BorreliagariniiCHNM4的能力 。

云南省大理市鼠、蜱中检测出斑点热群立克次体DNA

目的 了解鼠、蜱中自然感染斑点热群立克次体状况。方法 用PCR法检测鼠类脾脏和蜱类中的斑点热群立克次体DNA序列片段。结果 在云南省大理市下关野外山地捕获鼠类 9种 5 1只 ,从大足鼠 (1/ 15 )、大绒鼠 (1/ 7)和短尾 (1/ 8)各检出阳性 1份 ,其他鼠种均为阴性 ,总阳性率为 5 .88%。从采自弥渡县的 2 0 8只勐突血蜱中检出阳性 5份 ,阳性率为 2 .40 %。结论 初步认为云南省大理地区存在斑点热疫源地。

PCR检测蜱中查菲埃立克体DNA及其序列分析

应用从查菲埃立克体１６ＳｒＲＮＡ基因序列高变区构建的特异引物，进行ＰＣＲ，检测蜱标本中病原体ＤＮＡ。结果从云南采集的龟形花蜱、从福建采集的越原血蜱和卵形硬蜱扩增出３８９ｂｐ的特异ＤＮＡ片段。收集龟形花蜱和越原血蜱的特异ＰＣＲ产物，通过与Ｔ载体连接，进行克隆和序列测定。其ＤＮＡ序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置相差一个核苷酸，与其它种埃立克体的同源性为８０．７％～９６．１％。这是首次在我国发现埃立克体存在的病原线索。

我国一些常见蜱种莱姆病螺旋体的分离与鉴定

本文对我国不同地区 8种蜱感染莱姆病螺旋体的情况进行了分离培养 ,从内蒙获得 2个分离株 ,对分离株的 16srDNA基因序列进行分析比较 ,发现新分离的两株莱姆病螺旋体同我国报道的CHY13p株具有高度同源性 ,CHY13p与CHNM4有 2个碱基差异 ,CHY13与CHNM5只有 1个碱基差异 ,而CHNM4和CHNM5两株螺旋体有 2个碱基差异。可初步认定新分离莱姆病螺旋体系Borreliagarinii。

新分离的冠状病毒与严重急性呼吸综合征病原关系的研究

目的 确定新分离的冠状病毒与目前流行的严重急性呼吸综合征的病原关系。方法 以用细胞培养法从严重急性呼吸综合征病例标本中分离出的冠状病毒为抗原 ,通过免疫荧光染色及中和试验测定严重急性呼吸综合征患者血清中抗新分离的冠状病毒的抗体 ,分析确定新冠状病毒与严重急性呼吸综合征的病原关系。结果 在临床确诊的 1 1 3份严重急性呼吸综合征患者血清标本中 ,99份检测出有抗新冠状病毒的抗体。 1 0对双份血清检测结果显示 ,后采集的血清抗体效价均比发病初期采集的明显增高 ,最高的升高 1 2 8倍。中和试验结果证明 ,病人血清抗体能够中和新分离的冠状病毒。结论 新分离的冠状病毒与此次流行的严重急性呼吸综合征密切相关 。

北京市褐家鼠种群遗传多态性及与汉坦病毒分布关系的研究

目的了解北京地区褐家鼠不同地理种群遗传多态性与该地区汉坦病毒(HV)基因变异及其分布可能存在的关联.方法选取北京市不同地区捕获褐家鼠,采用巢式RT-PCR法检测HVM基因片段,获得的阳性标本产物进行直接测序,构建系统发育树.另一方面对不同HV来源的宿主个体和其对应种群内随机选取的其他个体,以及其他一些地区鼠类作为参照,用随机扩增多态DNA(RAPD)技术获得褐家鼠基因组DNA多态性图谱,利用RAPDDIST和PHYLIP软件分析褐家鼠种群多态性,并与对应的北京地区的HV差异和分布进行比较.结果选用50个随机引物进行扩增,有5个引物获得清晰、多态性高的RAPD谱带.不同区域种群RAPD标记不尽相同,北京市褐家鼠地理种群之间存在一定程度的遗传分化,大部分种群遗传距离较为接近,其中采集于某农产品集散地的XFD种群遗传距离相对较大,有特异性标记条带.11个HV代表序列均为汉城型汉坦病毒,基因差异为0.1%～8.0%,可分为2个主要的支系,多数毒株变异类型在不同地域中交叉分布,但BjFT01株变异较大,成一个独立的支系.通过Bootstrap分析和系统树图比较,种群分化较大的XFD种群与该区获得1株亲缘关系相对较远的HV相对应.结论北京市不同区域HV及其褐家鼠DNA多态性均存在一定差异,不同种群尤其是输入性种群对北京HV流行影响程度不同,初步显示一些特定种群与特定的基因性别有一定的关联.XFD种群外源基因交流渗入的可能性较大,进一步证明北京市HV随着鼠类种群迁移输入的可能性极大,但仍有待于选用一些特异性标记基因多态性进行继续研究.

黑龙江全沟硬蜱中检测出类似人粒细胞埃利希体的病原体DNA

目的 寻找我国蜱中人粒细胞埃利希体感染存在的病原学证据。方法 应用从人粒细胞埃利希体 16SrRNA基因构建的特异引物进行半套式PCR ,检测蜱标本中埃利希体DNA。然后对PCR扩增产物进行克隆和序列测定 ,与已知序列进行同源性比较。结果 从黑龙江采集的全沟硬蜱 (Ixodespersulcatus)中扩增出特异DNA片段 ,计算最小阳性率为 0 8%。对 919bp的扩增产物进行序列分析 ,证实为埃利希体DNA ,与美国人粒细胞埃利希体分离株对应序列比较 ,相差 4个核苷酸。结论 这是首次证明我国有类似人粒细胞埃利希体的病原体存在。

甘露糖结合凝集素基因多态性与肺结核易感性的研究

目的探讨甘露糖结合凝集素(MBL)基因多态性与中国汉族人群肺结核发病间的关联。方法采用以医院为基础的病例对照研究设计,对结核病相关危险因素进行问卷调查。联合应用引物序列特异性PCR(PCR-SSP)和序列特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-SSOP)等方法对MBL基因H／L、X／Y、P／Q和A／B四个多态性位点进行基因型分析及单倍体型分析。将各位点的基因型或单倍体型在病例组和对照组的分布进行比较,并将有显著作用的环境危险因素纳入进行多因素非条件logistic回归分析。结果 133名肺结核病例和177名对照纳入本研究,多因素分析调整结核病暴露史和疫苗接种史两个因素后,MBL基因的HL和LL基因型与疾病的保护作用显著相关,调整OR值(95％CI)分别为0．54(0．30-0．95)和0．50(0．26-0．96)。MBL基因XB组单倍体型与中国汉族人群肺结核发生的易感性显著相关,调整OR值(95％CI)为1．60(1．07-2．41)。而其余多态性位点,包括X／Y、P／Q和A／B位点与肺结核的发生均无显著性关联。结论中国汉族人群MBL基因多态性可能与汉族人群肺结核发生的易感性显著相关。

我国部分林区鼠中莱姆病螺旋体的分子流行病学调查研究

目的了解我国部分林区鼠中莱姆病螺旋体感染及其基因分型情况。方法应用巢式PCR扩增鼠中莱姆病螺旋体5S-23S rRNA间隔区片段,对阳性产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果共检测鼠8属19种455只,感染莱姆病螺旋体的有4属8种26只,感染率为5.71%。内蒙古、黑龙江、浙江、贵州林区鼠的感染率分别为3.45%、4.84%、8.00%、7.14%;其中东北林区(包括内蒙古和黑龙江)棕背鼠平的感染率为9.09%;浙江林区社鼠的感染率为9.26%;未发现新疆林区鼠感染莱姆病螺旋体。RFLP分析结果显示内蒙古、黑龙江林区鼠中莱姆病螺旋体均为B.garinii基因型,而浙江、贵州林区鼠感染的莱姆病螺旋体包括B.garinii和B.valaisiana两种基因型。结论东北林区及浙江林区以B.garinii基因型为主,棕背鼠平、社鼠可能分别是两地林区莱姆病螺旋体的主要储存宿主。

用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体

目的 了解福建西北部林区查菲埃立克体 (Ehrlichiachaffeensis)的存在情况。方法 用 16SrRNA基因特异引物进行半套式PCR ,检测从福建武夷山和宁化采集的蜱类及野生动物中的查菲埃立克体DNA ,然后对有代表性的标本的扩增产物进行克隆和序列测定 ,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较。结果 从该地区的越原血蜱 ,野鼠(褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠、小家鼠 )和野兔的脾脏和 /或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异片段。越原血蜱成蜱 2 40组 (6 16只 ) ,31组阳性 ,最小阳性率 5 0 %。野鼠脾脏标本 39份 ,2 2份阳性。野鼠和野兔血块标本共 35份 ,14份阳性。 390bp的PCR产物经克隆、测序后分析发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置一致。结论 福建西北部林区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地。

我国部分地区蜱中莱姆病螺旋体的检测与基因分型研究

目的对我国部分地区的多种蜱类进行莱姆病螺旋体的检测和基因分型。方法选择我国黑龙江、吉林和浙江省部分林区为调查点,采集当地蜱类,用巢式PCR法进行检测,阳性产物进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析和单链构象多态性(SSCP)分析,确定莱姆病螺旋体的基因型。结果共检测蜱512只,阳性126只,阳性率24.61%。其中吉林全沟硬蜱带菌率为37.00%,黑龙江全沟硬蜱带菌率为20.87%,浙江长角血蜱带菌率为28.07%。RFLP分析表明,蜱中莱姆病螺旋体包括B.garinii和B.afzelii两种基因型。SSCP分析显示为7种亚型,其中B.garinii分为5个亚型,B.afzelii分为2个亚型。发现有3只蜱同时感染不同基因(亚)型莱姆病螺旋体。结论证实B.garinii和B.afzelii基因型为我国莱姆病螺旋体的优势基因型,并在我国蜱中发现莱姆病螺旋体不同基因(亚)型的混合感染。

莱姆病人工宿主动物模型的建立

为了建立莱姆病人工宿主模型进行实验传播研究 ,用从我国全沟硬蜱分离的莱姆病螺旋体BorreliagariniiCHNM4人工感染 4种实验动物。结果表明 ,以 0 1× 10 6条 mL的剂量皮下注射 3日龄昆明小鼠是比较理想的方案。由此建立的动物模型既能用作全沟硬蜱的血源动物 ,又能在 15天内保持所感染螺旋体对全沟硬蜱的感染力 ,可作为人工宿主动物模型。

长角血蜱、嗜群血蜱经期传播莱姆病螺旋体Borrelia garinii的实验研究

目的 探讨长角血蜱、嗜群血蜱经期传播莱病螺旋体的可能性。方法 通过皮下注射KM鼠建立实验感染动物模型 ,以此阳性感染鼠感染试蜱非感染种群 ,观察试蜱的感染能力以及以莱姆病螺旋体的保持能力。结果 通过剌叮阳性KM鼠 ,长角血蜱、嗜群血蜱幼蜱饱血后分别获得 6 1 3%、75 0 %的阳性感染 ,但所感染的螺旋体在感染后 2d即死亡消解 ,不能重新获得分离 ,PCR扩增阳性也只能持续到饱血后 8d ,幼蜱蜕化为若蜱后 ,所有检测结果均为阴性 ;这两种蜱的若蜱也都可通过吸血获得 70 0 %的检测阳性率 ,感染后长角血蜱、嗜群血蜱可分别在在饱血后 5、10d内保持螺旋体的活性 ,PCR检测阳性率可延迟至饱血后 15d。此后直至蜕化成为成蜱 ,所有血、蜱检测结果均呈阴性 ;长角血蜱、嗜群血蜱的不同种群在感染和保持螺旋体能力上表现一致。结论 长角血蜱、嗜群血蜱的幼蜱和若蜱虽可以感染莱姆病螺旋体但不能经期传播到下一发育阶段 ,不具备经期传播能力 ,作为莱姆病主要媒介的可能性不大。