蛋白质的氧化重折叠

经过近几十年来广泛而深入的研究 ,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。 1 在已研究过的蛋白质中 ,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠 ,这与折叠能量景观学说是一致的。 2 正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂 (BPTI)折叠中所起的重要作用并非相互排斥 ,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需 ,与控制肽链折叠无直接关系。 3 根据对BPTI的研究 ,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用 ,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明 ,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成 ,更具有普遍意义。 4 在氧化重折叠的早期 ,二硫键的形成基本上是一个随机过程 ,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外 ,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述 ,在折叠的后期 。

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的表达

以Tac为启动子构建了牛凝乳酶原B基因表达质粒pTaAC,转化大肠杆菌JM105,对数生长期加入0.1mmol/L IPTG能明显诱导凝乳酸原的产生。基因表达除受IPTG的影响外,也受温度的调节控制。在30℃培养,IPTG存在时,凝乳酶原产量极低;在42℃无IPTG的条件下,基因也能表达。按电泳扫描计算凝乳酶原蛋白占细胞可溶性总蛋白量的12—19%,按ELISA法测定凝乳酸原产量为80—100mg/L,经变性、复性及酸化有活性的凝乳酶产量为14—20mg/L。

科技资源共享研究框架体系的探讨

科技资源共享是一项复杂的系统工程,既需要实践也需要理论研究。本文系统地探讨了科技资源共享的理论研究方法和内容,首先建立了科技资源共享研究框架体系,包括共享的基础研究、过程研究和价值实现研究三大部分,在此基础上,分别对科技资源的属性和特点、实证和模型、价值规律、共享与人文、产权关系、共享服务、评估与监督、共享的实践和科技资源的产业链等方面进行了研究。

腾冲嗜酸热两面菌S5分子伴侣β亚基的表达、纯化和活性的初步分析

用NdeI和BamHI酶切回收腾冲嗜酸热两面菌S5的分子伴侣β亚基基因片段插入pET-23b的相应位置,并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami^(TM)B(DE3)pLysS中表达。表达的β亚基以可溶的形式存在。β亚基在Rosetta-gami^(TM)B(DE3)pLysS中表达较高,其占菌体总蛋白的16．2%,且以单体和聚体形式同时存在。表达的菌体经超声破碎、70℃热处理后,上清中β亚基蛋白含量达到30%,再经(NH_4)_2SO_4沉淀、Bio-Gel A-1．5m和DEAE-Sepharose CL-6B柱层析,得到在SDS-PAGE呈电泳均一的β亚基,Native-PAGE表明其为聚体,有弱的ATPase活性。

反向PCR方法克隆腾冲嗜酸两面菌的分子伴侣基因

根据已知的Sulfolobus属的分子伴侣基因,设计简并引物,用PCR的方法从腾冲嗜酸两面菌(Acidianus tengchongensis)基因组DNA中分别克隆到了分子伴侣α亚基和β亚基的约500bp的基因片段。以它们为探针进行Southern杂交,确定了合适的限制性内切酶。以确定的限制性内切酶消化的基因组DNA环化物为模板,进行反向PCR反应,引物的延伸方向由已知序列出发沿环化分子向未知区域进行,扩增产物经测序表明为α亚基和β亚基基因。根据所得序列分别设计两对引物进行PCR,测序结果表明得到了α亚基和β亚基的完整基因。

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys2 0 6 Cys2 10进行定位突变过程中发现 ,在相应的模板序列中有自身形成自由能为 - 16 1kcal/mol的茎环结构倾向 ,妨碍与引物结合 ,从而难以合成突变的DNA ,采用快退火可解决此矛盾。 5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达 ,除C2 0 6A外 ,约占细胞总蛋白的 5 0 %左右。突变体的复性结果表明 ,Cys2 0 6 Cys2 10对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的 ,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响 ,在 5个突变体中 ,C2 0 6A/C2 10A的复性率分别为C2 0 6S/C2 10S、C2 10A、C2 10S的 4 5倍、2 0倍和 30倍 ,而C2 0 6A完全不能复性。C2 0 6A/C2 10A与C2 0 6S/C2 10S的远紫外CD光谱与野生型基本相同 ,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变 ,而荧光强度有显著增加。由于上述 3个蛋白具有相同比活 ,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象 ,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β转角的功能，利用基因突变技术，将该转角的氨基酸残基（Ｌｅｕ２０Ｇｌｙ２１Ｔｈｅ２２Ｐｒｏ２３Ｐｒｏ２４Ｇｌｎ２５）改为（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＧｌｙＧｌｎ２５）、（Ｌｅｕ２０ＳｅｒＧｌｙＧｌｎ２５）或（Ｌｅｕ２０ＧｌｙＳｅｒＧｌｎ２５），得到３个突变牛凝乳酶原表达质粒ｐＭＣＧＧ，ｐＭＣＳＧ和ｐＭＣＧＳ。除ｐＭＣＧＳ不能在大肠杆菌中表达外，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ均能以包含体的形式进行表达，且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样，ｐＭＣＧＧ和ｐＭＣＳＧ的表达产物经过变性复性，均能自活化为假凝乳酶，而且复性后的酶原突变体在ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ上的柱行为与野生型相类似，但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小，但对酶的催化效率影响较大。

蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A的表达及性质的研究

克隆了AspergillusnigerT2 1中的蛋白质二硫键异构酶相关蛋白A(PRPA)基因 ,并将它插入pET2 3b表达载体。在E .coli中表达时 ,PRPA占菌体总蛋白的 34%。经过超声破细胞、硫酸铵分级沉淀和离子交换层析获得了纯度大于 90 %的重组蛋白。PRPA有二硫键异构酶活性。在PRPA存在下 ,变性和还原的溶菌酶复性率和复性速度降低 ,电泳结果表明溶菌酶聚集增多。

美国联邦实验室的绩效评价及其改革

该文对美国联邦政府实验室以提高绩效为目的进行的改革和采取的主要措施，以及改革的法律基础——美国政府绩效法进行了阐述，埘实验室砰价及考评过程中可用的评价方法进行了较详细的分析研究，最后对我国的实验室管理提出了相关的建议。

国家大型科学仪器中心建设的思考

该文在用系统的观点深入地分析了国家大型科学仪器中心的系统组成、对科技创新的支撑作用及其发展需求与发展趋势的基础上,与国家科技计划、区域发展、行业和学科发展等几个方面的需求相结合,提出了国家大型科学仪器中心建设的主要任务及建设与运行的管理机制。

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。

话语标记“你听着”的句法、语义及语用功能

话语标记“你听着”是由主谓结构演化而来的话语标记,产生了全新的句法语义功能,本文基于语料统计验证其话语标记特征,并进一步分析其话语模式、语义特征和语用功能。话语标记“你听着”有其特定的话语模式,句首、句中和句尾均可分布。话语标记“你听着”在语义上具有明显的主观性和交互主观性。话语标记“你听着”的语用功能表现在人际和语篇两个方面,人际包括引入说话者的观点、态度和展现听说双方的角色关系,语篇则主要起话轮建构和语篇衔接连贯的作用。

美国杰克逊研究所简介

美国杰克逊研究所简介张渝英李冠民（国家科委，北京杰克逊研究所是国际著名的实验动物保种、研究机构，是近交系小鼠的发源地，也是用近交系小鼠进行遗传和癌症研究的创始者。现将该研究所的情况作一单位介绍。基本情况杰克逊研究所位于美国缅因州一个小岛上的ＢａｒＨａ...

大力发展我国科学仪器事业 加强技术创新 发展高科技 实现产业化

科学仪器是对物质世界的信息进行测量与控制的基础手段和设备 ,在科学研究、国民经济和社会生活等方面日益发挥着巨大的作用。科学仪器的发展在一定程度上已成为反映一个国家经济水平的标志。在我国加入WTO的新形势下 ,“十五”期间我国科学仪器发展主要面向农业、食品、医药、卫生、环境等领域的重点需求 ,重点攻克光谱、色谱、电化学、软件及支撑系统研发中的关键、共性技术 ,解决仪器的技术创新能力不足等问题 ,提升我国科学仪器发展的技术水平、增强科研自我装备能力 ,为科技、经济和社会发展提供强有力的技术支撑。

碱性条件下溶解包涵体提高凝乳酶原复性率的机制

重组凝乳酶原的复性效率不仅依赖于复性条件,而且与包涵体的溶解条件(即变性条件)有关.含有凝乳酶原的包涵体在pH11,8mol/L脲中溶解后,其复性率较在pH8,8mol/L脲中溶解的可提高1倍,由20%左右提高到40%左右.其机制是碱性条件有利于破坏分子间交联的二硫键从而增加凝乳酶原的溶解度.更为重要的是碱性条件使凝乳酶原分子处于一种还原性更强更为伸展的状态,这种状态容易进行正确再折叠.

TRANSCRIPTION OF SUB-VIRAL RNAS in vitro CATALYZED BY RNA POLYMERASE Ⅱ FROM Saccharomyces cerevisiae 20 B-12

I. INTRODUCTIONEukaryotic DNA-dependent RNA polymerase cannot transcribe DNA faithfully in vitro in the absence of protein factors. Most surprisingly, however, RNA polymerase Ⅱ of plant origin is capable of transcribing viroid RNA into full length