自由基对细胞膜和Ach受体效应的损伤及枸杞多糖的防护作用

本研究将爪蟾卵母细胞暴露于黄嘌呤氧化酶－次黄嘌呤（ＸＯ－ＨＰＸ）反应系统，观察自由基对细胞膜及其乙酰胆碱（Ａｃｈ）受体的损伤，结果表明，在自由基的作用下膜被动电学参数发生显著变化，其效果与ＸＯ－ＨＰＸ的浓度和作用时间成正比，ＸＯ－ＨＰＸ作用２ｈ不影响膜功能，大于４ｈ各项膜功能指标明显下降，Ａｃｈ极化反应减弱，上升时间延长，去极化幅度下降，下降１／２时间缩短；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）可消除自由基对上述膜参数的影响。枸杞多糖可以使损伤膜的被动电学参数改善，但对Ａｃｈ去极化反应无恢复作用。结果提示，ＸＯ－ＨＰＸ反应系统是通过产生超氧阴离子自由基造成细胞膜和Ａｃｈ受体的损伤，枸杞多糖可对抗自由基对质膜的作用，但对Ｍ样受体无效。

D－半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应

小鼠ｓｃＤ－半乳糖５０和５００ｍｇ·ｋｇ－１·ｄ－１×６ｗｋ，游泳迷宫作业训练成绩降低：皮层和海马神经元Ｃ－ｆｏｓ，Ｈ－ｒａｓ原癌基因杂交效率和核仁组织区染色能力下降，神经元核浆面积比值，细胞密度，总蛋白和核酸含量下降。上述结果与老龄小鼠所见吻合，提示在Ｄ－半乳糖诱导下产生了拟脑老化效应。

D-半乳糖对神经元和成纤维细胞拟老化作用的实验研究

实验用体内、外相结合的方法，观察了Ｄ－半乳糖（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ，Ｄ－ｇａｌ．）对细胞的促老化作用。结果表明，Ｄ－ｇａｌ使培养大鼠胎脑神经元出现生长发育缓慢、突起脱落、死亡率增高等退行性变；大鼠肺成纤维细胞的体外分裂代数减少；人胎儿肺二倍体成纤维细胞（ＨＢＳ）分裂周期中Ｇ２－Ｍ期细胞减少、Ｇ－Ｇ１期细胞增加、ＤＮＡ含量下降，细胞增殖速度减慢；大鼠胎脑神经细胞和ＨＢＳ中ＳＯＤ含量降低，丙二醛（ＭＤＡ）水平升高，这些结果与次黄瞟呤（ＨＰＸ）－黄瞟呤氧化酶（ＸＯＤ）系统产生的超氧阴离子自由基（Ｏ－２·）作用一致。提示，Ｄ－ｇａｌ抑制细胞生长发育和分裂繁殖，加速细胞老化，其机理可能与Ｏ－２·等活性氧（ＲＯＳ）过荷引起的脂质过氧化有关。

D-半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机理

运用体内、体外相结合的方法观察了Ｄ－半乳糖（Ｄ－ｇａｌ）对脂质过氧化和蛋白质代谢的影响。结果表明：Ｄ－ｇａｌ使大鼠脑组织、家蝇头和培养大鼠神经细胞、人胚肺二倍体成纤维细胞（ＨＢＳ）均出现ＳＯＤ含量下降，ＭＤＡ和脂褐素（Ｌｉｐｏ）水平升高及大鼠全血中谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）水平降低等现象；此外，大鼠脑组织中总ＲＮＡ含量下降，可溶性蛋白减少，不可溶性蛋白增加，这些变化与老年对照相类似，也与黄嘌呤氧化酶－次黄嘌呤系统产生的Ｏ２结果一致。提示，在Ｄ－ｇａｌ的代谢过程中伴有活性氧自由基产生，以Ｏ２为主的自由基介导的脂质过氧化可能是该脑老化模型的主要原因。

D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变

建立类似自然衰老的“早衰老”动物模型是老年医学悬而未决的研究课题之一。国内外学者曾进行多种尝试,如低剂量放射诱导、抑制蛋白质合成以及去除胸腺等方法。近几年徐黻本等在D—半乳糖亚急性中毒动物观察了临床上常用的20项指征(内部资料),与衰老指征相似。

施普善对衰老小鼠SOD以及MDA影响的实验研究

目的 探讨施普善对衰老小鼠 SOD和 MDA的影响。方法 采用 D-半乳糖诱导的脑老化小鼠动物模型 ,用化学发光法测定 SOD活性 ,用硫代巴比妥酸比色法测定 MDA含量。结果 施普善能显著提高脑以及肝脏组织中 SOD活力 (P<0 .0 5,P<0 .0 1 ) ,降低 MDA含量 (P<0 .0 1 )。结论 施普善具有明显抗氧化能力。

淀粉样β蛋白和自由基对爪赡卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体功能的影响

目的 :探讨淀粉样 β蛋白 (Aβ1-4 0 )和自由基对爪蟾卵母细胞表达的大鼠脑谷氨酸受体 (GluR)功能的影响。方法 :采用Promega试剂盒提取 3月龄大鼠脑组织总RNA和mRNA ,并将 5 0nl(5 0ng)的mRNA显微注射到每个爪蟾卵母细胞。注射后的卵母细胞在 (19± 1)℃条件下以改良的巴氏液孵育进行受体表达。这些表达的受体的激活电流采用双电极电压钳位技术记录。超氧阴离子自由基 (SAFRs)和Aβ1-4 0 于记录前 12h、2 4h、96h分别加入孵育液。结果 :爪赡卵母细胞可以表达出M型ACh、谷氨酸、多巴胺、GABA和 5 羟色胺受体。Aβ1-4 0 对表达的GluR有抑制效应 ,其程度依作用时间和浓度而异。 2 0nmol/LAβ1-4 0 作用 2 4h对表达的GluR功能无影响。与SAFRs共同孵育时 ,2 0nmol/LAβ1-4 0 作用 12h即对表达的GluR功能有明显影响 ,6 0nmol/LAβ1-4 0 作用 12h即对表达的GluR有明显抑制效应 (降低 2 1% ,P <0 .0 5 ) ,而 6 0nmol/LAβ1-4 0 作用 2 4h下降达 5 2 %。维生素E对这些效应有拮抗作用。结论 :自由基和Aβ对GluR具有抑制效应 ,该效应能被维生素E拮抗。

覆盆子对衰老模型小鼠脑功能的影响

采用小鼠Ｄ－半乳糖衰老模型，观察了中药覆盆子对学习记忆能力和脑单胺氧化酶Ｂ（ＭＡＯ－Ｂ）的影响。结果表明：覆盆子可明显缩短衰老模型小鼠的游泳潜伏期，降低脑ＭＡＯ－Ｂ活性。提示覆盆子具有改善学习记忆能力，延缓衰老的作用。

施普善对D-半乳糖拟衰老小鼠学习记忆功能的影响

目的:探讨施普善对D-半乳糖拟衰老小鼠学习记忆能力的影响及其机制。方法:采用D-半乳糖诱导的脑老化小鼠动物模型,分别用游泳水迷宫测定小鼠学习记忆能力;用化学发光法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性;用硫代巴比妥酸比色法测定丙二醛含量。结果:D-半乳糖模型组小鼠的游泳时间明显延长犤(44.91±12.86)s犦、正确次数明显降低犤(2.58±1.87)次/d犦,与正常对照组犤(28.11±12.75)s,(4.33±1.72)次/d犦相比,差异有显著性意义(t=3.694,t=3.258,P<0.01)。应用施普善6周后,其大、中剂量组小鼠的游泳时间明显降低犤(28.06±13.06),(27.85±13.21)s犦,正确次数明显增加(4.58±1.66),(4.63±1.81)次/d犦,与D-半乳糖组相比,差异均有显著性意义(t=3.574,3.508;t=3.416,3.349,P<0.01);并能显著提高脑组织中SOD的活性犤(30232.38±5133.53),(29653.26±4878.64)nkat犦,降低丙二醛含量犤(630.00±59.40),(626.74±49.68)nmol/g犦,与D-半乳糖组犤(22892.74±4540.07)nkat,(749.69±92.80)nmol/g犦相比,差异均有显著性意义(t=3.418,3.277;t=3.168,3.337,P<0.01)。结论:施普善能明显的改善D-半乳糖诱导的脑老化小鼠学习记忆能力,提高脑组织中SOD的活性,降低丙二醛的含量。

长寿灵对大白鼠多发性脑梗塞性痴呆模型的影响

经左心注射0.25ml/kg 液体石蜡栓子(LD_(10)剂量)可以建立多发性脑梗塞大白鼠模型,形成多发性脑栓塞,并破坏学习记忆功能。动物在 T 型游泳迷宫中的学习记忆成绩下降,倾斜板实验示协调运动功能降低,体位性心率反射示心血管神经调节功能减退,脑比重下降,脑组织 K^+/Na^+比值下降。大白鼠心、肝、肾无明显栓塞表现。长寿灵和尼莫地平有防治多发性脑梗塞性痴呆的疗效,能改善学习记忆功能和协调运动功能的减退,在左心注射 LD_(90)剂量液体石蜡栓子(1.00ml/kg)的大白鼠中长寿灵能降低缺血急性期的病死率。

自由基损伤与D-半乳糖所致细胞老化关系

实验观察了Ｄ－半乳糖（Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ），超氧阴离了自由基Ｏ和Ｈ２Ｏ２对培养人胚肺二倍体成纤维细胞（Ｈｕｍａｎｆｅｔａｌ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＨＢＳ）的促老化作用。结果表明，Ｄ－十乳糖和Ｏ２均使细胞增殖速度减慢，分裂周期中Ｇ２－Ｍ期细胞比例减少、Ｇ－Ｇ１期细胞比例增加、ＤＮＡ含量下降，此外，细胞中ＳＯＤ含量降低，丙二醛（Ｍａｌｏｎｄｉｌｄｅｈｙｄｅ，ＭＤＡ）水平升高。Ｈ２Ｏ２上述作用不明显。提示，在Ｄ－半乳糖的代谢过程中可能产生了Ｏ２等活性氧自由基，Ｏ２本身和／或其与Ｈ２Ｏ２进一步反应生成的羟自由基（·ＯＨ）过量引起的组织细胞损伤及抗氧化酶活力下降、过氧化产物增多可能是Ｄ－半乳糖诱发细胞老化的主要原因。

垂体腺苷环化酶激活多肽抑制β淀粉样蛋白对Neuro-2a细胞神经毒性作用的机制

通过MTT方法检测细胞活性 ,同时采用激光共聚焦显微镜技术检测细胞内游离钙离子的瞬时运动 ,研究了垂体腺苷环化酶激活多肽 (pituitaryadenylatecyclaseactivatingpolypeptide 2 7,PACAP2 7)通过调节细胞内钙对抗淀粉样蛋白Aβ2 5 35引起Neuro 2a细胞神经毒性作用的可能机制。结果表明 ,PACAP在一定浓度范围内 (<0 1μmol/L)可提高Neuro 2a细胞增殖能力并对抗Aβ引起的神经毒性 ,此作用可以被PACAP受体竞争性拮抗剂PACAP6 2 7所抑制。 2 5 μmol/LAβ使细胞内钙离子缓慢上升 ,并有一个较长时间的平台期。 0 1μmol/L的PACAP使细胞内钙离子迅速升高后下降 ,10min后回到接近基线水平 ,伴有较长时间的不应期。用PACAP预处理细胞 10min后Aβ引起细胞内钙的慢上升不再出现。推测 ,PACAP受体激活引起瞬时内向钙离子运动 ,而后伴随一个较长时间的不应期 ,可能是一个消除凋亡或阻止凋亡启动的保护机制。

注射老龄大鼠脑皮层mRNA的爪蟾卵母细胞对乙酰胆碱，谷氨酸和5－羟色胺的反应

从老年（３２月龄）和成年（３月龄）大鼠大脑皮层提取多聚腺啤呤ｍＲＮＡ，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的神经递质受体。用电生理方法检测乙酰胆碱，谷氨酸和５－羟色胺诱发的去极化反应，揭示老化脑递质受休反应的变化。注射老年大鼠大脑皮层ｍＲＮＡ的卵母细胞对三种递质诱发反应去极化幅度下降，上升时间及潜伏期延长，Ｔ１／２缩短，与成年对照组有显著性差异；三种递质受体反应幅度约为成年对照组的４０％－６０％，其变化趋势相同。

PACAP受体激活对抗Aβ_(25-35)致神经元凋亡作用的观察

目的和方法 :本研究采用体外原代培养新生大鼠海马神经元的方法探讨了垂体腺苷环化酶激活多肽(PACAP)对抗淀粉样蛋白 (Aβ2 5-3 5)致凋亡的作用机理。结果 :2 5 μmol/L的Aβ蛋白处理神经元 5d即有明显的凋亡特征出现。PACAP2 7(P2 7)在正常情况下对海马神经元无明显营养作用 ,但当Aβ导致神经元凋亡时P2 7有显著的保护作用 ,可以提高神经元的活性 ,减少细胞凋亡数目 ,降低基因组小片段DNA含量。PACAP受体拮抗剂PACAP6 - 2 7(P6 - 2 7)可以逆转P2 7的保护作用。结论 :研究结果说明PACAP通过受体激活参与对抗Aβ的神经毒性效应。

银杏提取物对淀粉样β蛋白致PC12细胞凋亡的保护作用

目的:探讨银杏提取物对淀粉样β蛋白(Aβ)致PC12细胞凋亡的保护作用。方法:应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)分析法研究细胞活性的改变,应用激光共聚焦显微镜进行线粒体膜电位测定。TUNEL法测定细胞凋亡率。结果:随着Aβ浓度的加大,PC12细胞的存活率逐渐降低。同时给予Aβ及不同剂量的银杏提取物,可明显提高PC12细胞的存活率。银杏提取物可减少Aβ所致的细胞凋亡,Aβ组细胞凋亡率为63%,高于银杏组21%(χ2=36.2069,P=0.0000)。结论:银杏提取物可抑制Aβ诱导的PC12细胞凋亡。

β淀粉样蛋白与氧应激的相互作用及PACAP-27对氧应激损伤的保护作用

目的 :探讨 β淀粉样蛋白 (Aβ)与氧应激损伤的相互关系及脑下垂体腺苷环化酶激活多肽 2 7(PACAP 2 7)对抗氧应激致神经瘤细胞损伤的作用机理。方法 :体外培养第 15 0代Neuro 2a细胞 ,MTT法检测细胞存活率 ,Heochest332 5 8特异细胞核染色观察凋亡小体 ,提取基因组DNA鉴定细胞死亡方式及基因组内小片段含量。结果 :过氧化氢 (H2 O2 )处理接种 2 4h的Neuro 2a细胞 2 4h后 ,浓度相关地使细胞存活率下降 ,10mol·L-1时有明显的凋亡特征出现 ;与 2 5mol·L-1的Aβ2 5-35共同处理 2 4h可以使H2 O2 损伤神经元的ED50 降低至 1/10 ;PACAP 2 7( 0 .1(mol·L-1,1d加药 1次 ,共 2次 )对H2 O2 所致的细胞损伤有显著的保护作用 ,可以提高细胞的存活率 ,降低基因组小片段DNA的含量 ;PACAP受体拮抗剂PACAP 6 2 7( 10 0mol·L-1,与PACAP同时加药 )不能拮抗PACAP 2 7的保护作用。结论 :氧应激与Aβ在神经毒性方面有协同作用 ;PACAP参与对抗H2 O2 的神经毒性时 ,不通过受体激活。

淀粉样β蛋白对小胶质细胞活化作用的体外观察

目的:观察淀粉样β蛋白对小胶质细胞活性、形态学以及分泌炎性细胞因子的作用,为阿尔茨海默病的炎性反应机制及抗炎治疗提供体外依据。方法:实验于2003-03/2004-03在解放军总医院老年医学研究所进行。应用BV-2细胞作为体外小胶质细胞模型,加入不同浓度淀粉样β蛋白25～35或1～42(5,10,20,40,60μmol/L)及20μmol/L不同孵育状态(37℃孵育3,6,12,24h、3,5和7d)的淀粉样β蛋白25～35或1～42分别培养2～24h。四唑盐法检测淀粉样β蛋白对细胞活性的影响,倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,并应用放射免疫法测定加入淀粉样β蛋白后BV-2细胞上清白细胞介素1β及白细胞介素6水平。结果:①细胞活性:淀粉样β蛋白对BV-2细胞的生存活性没有影响(P均>0.05)。②细胞形态学改变:在较低浓度时(5～10μmol/L)淀粉样β蛋白1～42就可以使BV-2细胞出现明显的形态学改变(多数细胞聚集成团,有的胞体变得肥大,胞核大而圆,核仁明显;有的胞体变为梭形,由胞体伸出一个或多个较长的枝状突起),与淀粉样β蛋白1～42孵育状态有关(37℃孵育5～7d时最为明显),而淀粉样β蛋白25～35无此作用。③白细胞介素1β水平:淀粉样β蛋白1～42与25～35均可以刺激BV-2细胞分泌,二者作用类似。20μmol/L淀粉样β蛋白作用6h后其水平升高,至12h达到高峰,约为对照组的3倍,此后逐渐下降(P<0.01)。当不同浓度淀粉样β蛋白作用12h时,淀粉样β蛋白为20μmol/L时在上清中可以检测到白细胞介素1β明显增加,此后随着浓度的增加其分泌也逐渐增加,至60μmol/L时为对照组的5倍(P<0.01)。④白细胞介素6水平:各淀粉样β蛋白处理组细胞上清液均不能检测到其水平有明显变化。结论:淀粉样β蛋白对BV-2细胞的生存活性没有影响,淀粉样β蛋白可以激活BV-2细胞发生形态学改变并释放炎性细胞因子,但二者的作用途径不同,形态学改变与淀粉样β蛋白片段及聚集状态均有关;而分泌白细胞介素1β与淀粉样β蛋白片段及聚集状态均无关,并且这种刺激作用具有时间以及浓度依赖性。

爪蟾卵母细胞表达的淋巴细胞mAch受体的氧应激损伤

目的和方法：将羊外周血淋巴细胞ｍＲＮＡ注入非州爪蟾卵母细胞胞浆内，借助卵母细胞的翻译系统，表达淋巴细胞的Ｍ型Ａｃｈ受体（ｍＡｃｈＲ）并移植到卵母细胞膜上。电位箝位法检测受体电流，观察氧应激对电流的影响。电生理实验前，将注射ｍＲＮＡ后的卵母细胞暴露于次黄嘌呤－黄嘌呤氧化酶或ＦｅＳＯ４－Ｈ２Ｏ２自由基反应系统，用电压箝位记录系统观察自由基对表达受体电流的作用。结果：随着自由基浓度增加，作用时间延长，表达的ｍＡｃｈＲ电流幅度下降；超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）或过氧化氢酶（ＣＡＴ）可分别对抗Ｏ－·２和·ＯＨ造成的电流下降。结论：自由基对表达的ｍＡｃｈＲ电流的损伤作用存在量效和时效关系，ＳＯＤ和ＣＡＴ能分别有效地消除Ｏ－·２、·ＯＨ。

D-半乳糖拟衰老模型大鼠的神经递质受体机制

目的:探讨神经递质受体在D-半乳糖拟衰老模型大鼠发生中的作用。方法:选取3月龄Wistar大鼠40只,随机分为对照组20只、D-半乳糖组20只,每组动物雌雄各半。同期选取18～36月龄雌性非洲爪蟾(购自中国科学院发育所)20只为自然衰老组。对照组大鼠每日于颈背部皮下注射生理盐水,D-半乳糖组每日颈背部皮下注射D-半乳糖50mg/(kg·d),两组给药体积均为10mL/kg,连续给药6周。采用Morris水迷宫方法检测每只大鼠到安全岛的平均时间。各组大鼠Morris迷宫测定后快速断头取全脑,提取RNA。采用显微注射法,将所提取的RNA注射于成熟的爪蟾卵母细胞中,采用电压钳位方法记录表达到非洲爪蟾卵母细胞膜上的神经递质受体通道电流。结果:①脑组织总RNA含量:D-半乳糖组、自然衰老组和正常对照组比较差异无显著性意义(650.1±51.7,632.0±45.1,640.5±49.3,P>0.05)。②Morris迷宫检测:D-半乳糖组和自然衰老组的潜伏期明显比正常对照组延长[(23.1±6.4)s,(20.7±6.8)s,(15.4±5.3)s,P<0.01]。③脑神经递质受体峰电流检测:D-半乳糖和自然衰老组的乙酰胆碱明显低于正常对照组[(106.0±23.9),(90.9±14.1),(138.0±29.0)nA,P<0.01];D-半乳糖和自然衰老组的5-羟色胺明显低于正常对照组[(113.6±29.6,91.4±14.2,172.5±23.5)nA,P<0.05)。结论:D-半乳糖拟衰老大鼠和老龄组大鼠脑功能的衰退与其脑神经递质受体功能障碍有关。

论寿命学:2.梦想与现实

以人类最大寿命的相对有限性为基础 。