基于CRISPR/Cas9技术建立IGF2R基因修饰PK-15细胞

作为我国特色的地方种质资源,藏猪对高海拔、低氧、强紫外线辐射等恶劣环境具有良好的适应性,前期研究发现藏猪的IGF2R(insulin-like growth factor 2 receptor,IGF2R)基因在其内含子上有1段274 bp的缺失,且该缺失为藏猪独有的变异,关于IGF2R是否参与藏猪对低氧等恶劣环境的适应性调节的相关研究尚未报道。为了建立IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,研究IGF2R基因对藏猪低氧耐受特性的影响,通过CRISPR/Cas9技术建立基因修饰PK-15细胞系,并通过PCR、实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,RT-qPCR)、蛋白免疫印迹(Western-blot)、免疫荧光(immunofluorescence,IF)等方法鉴定其分子特征,随后分别利用CCK-8和RT-qPCR、Western-blot对基因修饰细胞进行活力和凋亡基因检测。结果显示,已成功构建IGF2R基因274 bp修饰的猪细胞系,IGF2R基因表达量极显著下调(P<0.01)。基因修饰细胞活力在72 h时极显著上升(P<0.01),并且含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase9)和BCL-2关联X(BCL2-associated X,BAX)蛋白的水平显著下调(P<0.05),并且B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCL2)基因的mRNA水平极显著上升(P<0.01)。成功构建了IGF2R基因精确修饰的PK-15细胞系,并初步进行了功能研究,为研究IGF2R基因功能提供细胞模型,并为后续基因编辑猪的制备奠定基础。