用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素(英文)

为探索用GAP启动子 (PGAP)取代AOX1启动子 (PAOX1) ,在毕节酵母 (P .pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性 ,应用PCR方法从P .pastoris染色体中扩增了GAP启动子 ,以其取代诱导型表达载体 pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体 pGAP9K。将人血管抑制素 (AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点 ,获得含AS基因的重组质粒 pGAP9K AS。转化P .pastorisGS115 ,对获得的高拷贝转化子P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)进行组成型表达 ,同时以诱导型转化子P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)作为对照。SDS PAGE结果显示 :组成型转化子于培养 4d后AS的表达水平已达到高峰 ,分泌量为 5 8mg/L ;而诱导型转化子诱导 4d后表达的AS仅是组成型表达的 70 % ,诱导 6d后达到高峰 ,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时 (4d)的 86 %。CAM分析和抗癌实验结果显示 :P .pastorisGS115 (pGAP9K AS)和P .pastorisGS115 (pPIC9K AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C5 7BL/ 6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长 ,其平均瘤重抑制率分别达到 90 6 1%和 90 5 4 %。以上结果表明 ,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点 ,PGAP可以取代PAOX1在P .pastoris中表达AS及其他外源蛋白。

人血管抑制素基因克隆、表达和生物活性分析

应用PCR技术从人胎肝cDNA文库中扩增了人血管抑制素基因。将克隆的基因重组进酵母质粒pPIC9K获得含该基因的重组质粒pPIC9KA3。用电激法将质粒pPIC9K转化毕节酵母GS115 ,经PCR检测获得含人血管抑制素基因的酵母工程菌GS115 (pPIC9KA3)。再用G418筛选法 ,在含不同浓度的G418平板上筛选高拷贝整合的转化子。对高拷贝整合的转化子进行发酵培养和诱导表达。SDS_PAGE及Western印迹分析显示 :表达产物约占胞外蛋白的 43% ,相当于 94mg L ,并具有免疫活性。并能抑制bFGF诱导的鸡胚尿囊膜新生血管的生成。还对用G418筛选高拷贝整合转化子的方法做了探索。

猪粪中间型耶氏菌的分离和特性

从海南岛昌江县和乐东县的农村家养猪猪粪便中，分离到三株中间型耶氏菌．这些菌株的主要特性是分解多种糖，均能分解鼠李糖、密二糖和棉子糖．

小肠结肠炎耶氏菌实验性感染家兔的病理学研究

本文报告应用小肠结肠炎耶尔森氏菌以６×１０８的细菌数，经静脉注射家兔的病理学观察实验结果表明，致病性血清型带毒力质粒小肠结肠炎耶尔森菌菌株Ｇ１５１（血清型０：９）和ＬＡＢ－８１８２（血清型０：３）引起家兔组织严重的病理学改变：血细胞渗出，微脓肿和菌落形成，组织变性坏死、溃疡．致病性血清型丢失毒力质粒的小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株８２－１４０（血清型０：８）注射的家兔组织病理学改变轻微．４９３－８０Ｖ－（血清０：９）不引起家兔组织病理学改变．

丢失毒力质粒的小肠结肠炎耶氏菌实验性感染家兔致病机理研究

本文报告应用致病性血清型丢失毒力质粒Ｙ．ｅ菌株４３９－８０Ｖ－及８２－１４０进行家兔体内感染，通过大体病变、组织病变和细胞病变的观察．研究其致病性及致病机理．结果表明：这两株Ｙ．ｅ．菌感染性与致病性明显弱于对照组──致病性血清型带毒力质粒Ｙ．ｅ菌株，其中．用４３９－８０Ｖ－菌株接种的家兔不发生感染与致病．用ＬＡＢ－Ｂ１８２菌株接种的家兔有排菌，肠粘膜上皮溃疡，急性脾炎病变．但无微脓肿及菌落形成．无组织细胞变性坏死．

小肠结肠炎耶氏菌实验性感染家兔的大体病变观察

本文报告应用小肠结肠炎耶氏菌以６×１０￣８的细菌数，经静脉注射家兔的大体病变观察。实验结果表明，致病性血清型带毒力质粒小肠结肠炎那氏菌Ｇ１５１（血清型０：９）和ＬＡＢ－Ｂ１８２（血清型０：３）引起家兔严重感染及病变：排菌、食欲和体重减轻，肠、肝、脾组织脓肿和溃疡形成，ＬＡＢ－Ｂ１８２菌株引起家兔肝和肠组织局灶性坏死。致病性血清型丢失毒力质粒的小肠结肠炎那氏茵茵株４３９－８０Ｖ￣－（血清型０：９）和８２－１４０（血清型０：８）不引起家兔明显的感染及病变：不排菌或排菌时间短，腹腔脏器组织无大体病变或病变极其轻微。

从海南岛200份猪粪便标本中分离耶氏菌

采用ＣＩＮ琼脂，从海南岛２００份猪粪便分离小肠结肠炎耶氏茵２株，中间型耶氏菌３株。分离率为２．５％。从猪粪便分离小肠结肠炎耶氏苗是省内首次报导。分离中间型耶氏菌具有国内先进性。

小肠结肠炎耶氏菌实验性感染家兔微观病变观察

应用透射电子显微镜观察致病性血清型带毒力质粒Ｙ．ｅ．Ｇ１５１及ＬＡＢ－Ｂ１８２菌株感染的家兔，其肠道及脾脏有微脓肿及菌落形成，在微脓肿形成的区域，组织细胞变性坏死严重．用ＬＡＢ—Ｂ１８２菌株感染的家兔，其肝脏可见局灶性凝固性坏死．在上述脏器无微脓肿及菌落形成的部位，肉眼观察正常，但在电子显微镜下．却呈现不同程度的组织细胞病变．细菌不在细胞内增殖．致病性血清型丢失毒力质粒的４３９—８０Ｖ－菌株感染的家兔，其肠道、肝脏及脾脏组织细胞无病理学改变．

小肠结肠炎耶氏菌体外毒力试验

为了初步研究小肠结肠炎耶氏菌（Ｙ．ｅ．）致病机理，本文报告应用依钙、自凝、刚果红平板毒力试验和质粒ＤＮＡ提取方法，进行Ｙ．ｅ．体外毒力探讨。结果表明：带毒力质粒的Ｙ．ｅ．菌株Ｇ１５１，９２０和ＬＡＢ－Ｂ１８２依钙、自凝和刚果红平板毒力试验阳性；不带毒力质粒的Ｙ．ｅ．菌株８２－１４０和４３９－８０Ｖ￣－依钙、自凝和刚果红平板毒力试验阴性。依钙、自凝、刚果红平板毒力试验阳性与携带毒力质粒的一致性以及依钙、自凝、刚果红平板毒力试验阴性与不携带毒力质粒的一致性表明：Ｙ．ｅ．的依钙、自凝和吸收刚果红特性是毒力质粒编码。

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。

稀硫酸预处理王草的研究

本研究采用稀硫酸对热研4号王草进行预处理,结合3,5-二硝基水杨酸法测定水解液中还原糖含量的方法,对稀硫酸浓度(v/v)、固液比(g/mL)、水解温度、水解时间和不同粒径5个因素进行单因素实验分析,在单因素试验的基础上通过二次回归正交旋转组合设计进行工艺参数优化。实验结果表明,最佳预处理条件,水解温度为117℃,水解时间为15min,稀硫酸浓度为3%,固液比为1∶15,粒径为0.425～0.850mm。

血管生成抑制素治疗血管瘤的研究

目的观察血管生成抑制素治疗血管瘤的效果。方法发酵毕赤酵母工程菌组成型表达重组血管生成抑制素,用SP-Sepharose Fast Flow(阳离子交换剂)柱进行蛋白纯化;通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成试验和诱发血管内皮细胞凋亡试验,分析重组血管生成抑制素的生物学活性,在血管瘤模型(公鸡肉垂)中注射血管生成抑制素,分析血管生成抑制素对血管瘤的药效。结果血管生成抑制素在毕赤酵母中高效表达,经过纯化,收获达98%的重组血管生成抑制素;重组血管生成抑制素具有抑制CAM血管生成和诱发血管内皮细胞凋亡的活性;重组血管生成抑制素与血管瘤模型作用14 d后,瘤体血管生长抑制率为51%(P<0.01),血管瘤增殖抑制率为39%(P<0.05)。结论成功制备重组血管生成抑制素药物,血管生成抑制素对于血管瘤模型具有显著的药效。

海南岛两个HbH家系α-珠蛋白基因型分析

∝-地中海贫血病在我国海南岛也是一种较为常见的遗传性疾病。本文报道应用∝-珠蛋白基因探针以及限制性内切酶图谱印迹杂交技术分析海南岛两个HbH家系（汉族）的∝-珠蛋白基因型。其中家系一（一家共六人:父、母、大姐姐、二哥哥、三哥哥及先证者林某）的∝-珠蛋白基因型分别为:先证者林某是非缺夫型与∝-地贫1双重杂合子（∝∝T/--）、父亲是∝-地贫1杂合子（∝∝/--）、母亲是非缺失型杂合子（∝∝T/∝∝）、大姐姐是∝-地贫1杂合子（∝∝/--）、两位哥哥是正常∝-珠蛋白基因型或非缺失型杂合子（∝∝/∝∝）或（∝∝T/∝∝）;家系二（一家共四人:父、母、哥哥及先证者范某某）的∝-珠蛋白基因型分别为:先证者范某某是∝地贫1与∝-地贫-1双重杂合子（-∝/--）、父亲是∝-地贫1杂合子（∝∝/--）,母亲是∝-地贫2杂合子（-∝/∝∝）,哥哥是正常∝珠蛋白基因型（∝∝/∝∝）。

高密度发酵P.pastoris诱导表达egⅡ基因

用套叠PCR法扩增里氏木霉(Trichoderma reesei)的葡聚糖内切酶Ⅱ(egⅡ)基因。扩增基因经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,获得重组表达质粒pPIC9K-egⅡ。通过电转法将egⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的转化子作为工程菌。工程菌的发酵在生物反应器中进行,在50 L的发酵罐中加入20 L发酵液。连续24 h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后以甲醇为碳源诱导egⅡ基因表达48 h。放罐时生物量为A_(600)=203,重组EGⅡ产量为90 mg/L。表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。

用P. pastoris的pAOX1表达系统表达木糖异构酶

目的:应用P. pastoris的pAOX1表达系统分泌表达重组木糖异构酶。方法:用PCR法从大肠杆菌基因组中扩增木糖异构酶基因(xi)。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切将其基因克隆进P. pastoris表达载体。通过电转法将其木糖异构酶基因重组于P. pastoris基因组,筛选G418抗性700μg/ml的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-xi)。在摇瓶中发酵用甲醇诱导表达重组木糖异构酶。用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况,用糖酵解法对表达产物进行活性分析。结果:木糖异构酶基因在pAOX1的调控下,在P. pastoris中经甲醇诱导能分泌表达,摇瓶发酵2d表达量为35mg/L,表达产物具有代谢木糖的作用。结论:成功地克隆了大肠杆菌的木糖异构酶基因,并实现用pAOX1系统在P. pastoris中表达中木糖异构酶,为用P. pastoris规模化生产重组木糖异构酶奠定了基础。

增加外源基因在植物中复制、转录和翻译的策略

与其他的真核表达系统(例如酵母和昆虫)比较,植物表达系统的主要优越性在于植物细胞具有全能性,能再生植株.这是植物表达系统能够以低廉的成本大规模生产重组蛋白的潜力.但是,由于植物表达系统重组蛋白表达产量低,使植物表达系统在大规模重组蛋白生产中的应用受到很大的影响.蛋白的产量与基因的数量、基因的转录和翻译水平密切相关.近年来,人们在增加外源基因在植物中复制、转录和翻译作了大量的探讨,使在植物表达重组蛋白产量低的问题得到改善.笔者综述了这方面的研究进展.

从海南岛300例腹泻病人粪便标本分离耶氏菌

采用CIN培养基，从海南岛300例腹泻病人粪便标本分离培养出耶氏菌11株．其中，小肠结肠炎耶氏菌4株，血清型0：3；中间型耶氏菌7株.这7个中间型耶氏菌菌株均能分解鼠李糖、密二糖和棉子糖．

Pichia pastoris表达系统的启动子研究进展

Pichia pastoris是近年迅速发展的一种真核表达宿主,具有高效和适于进行高密度发酵等优点,已广泛应用于生产重组蛋白。启动子是表达系统重要组成部分中表达载体的核心元件,它的特性直接影响着它所调控的外源基因的表达。本文简要介绍了P.pastoris表达系统启动子pAOX1,pFLD1,pGAP,pYPT1和pICL1研究进展。