RAC1通过调节紧密连接蛋白1分布影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭

目的:探讨小GTP酶Rac1(Rac family small GTPase 1,RAC1)对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及机制。方法:构建pLKO.1-puro RAC 1 shRNA载体,包装慢病毒,感染卵巢癌细胞OVCAR3和SKOV3,并采用嘌呤霉素筛选;通过蛋白质印迹、细胞划痕和基质胶侵袭实验分别检测细胞中RAC 1敲减效率,细胞迁移和侵袭能力的改变;采用蛋白质印迹和免疫荧光染色观察细胞中紧密连接蛋白1(tight junction protein 1,TJP1)的表达和分布变化。结果:酶切电泳和测序结果均显示pLKO.1-puro RAC 1 shRNA慢病毒载体构建成功,蛋白质印迹结果证实感染RAC 1 shRNA慢病毒的OVCAR3和SKOV3细胞中RAC1蛋白水平较对照组明显下降(P<0.05)。细胞划痕和基质胶侵袭实验证实,RAC 1敲减后卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力较对照组显著下降(P均<0.01);蛋白质印迹结果显示RAC 1敲减后卵巢癌细胞中TJP1蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但免疫荧光染色表明TJP1由胞质内散在分布转变为细胞间连接处聚集分布,细胞间连接更加紧密。结论:RAC 1基因可能通过改变TJP1蛋白分布从而影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭。

小鼠microRNA-31反转录病毒载体重组质粒的构建及鉴定

目的:以p MSCV-puro载体(MGP)为骨架,构建带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的小鼠micro RNA-31(mi R-31)反转录病毒载体MGP-31。方法:PCR扩增带有NotⅠ以及XhoⅠ酶切位点的mi R31的前体(premi R-31)序列,然后克隆至MGP载体上,测序鉴定。将构建的MGP-31质粒转染HEK-293T细胞,通过荧光显微镜观察GFP的表达情况,实时定量PCR检测mi R-31转录水平以评估MGP-31质粒的转染效率。结果:基因序列分析显示pre-mi R-31基因序列正确,并成功插入MGP载体,转染HEK-293T细胞可表达GFP,实时定量PCR结果表明转染MGP-31质粒的HEK-293T细胞可高表达mi R-31。结论:MGP-31反转录病毒载体构建成功。

上皮卵巢癌细胞系LncRNAs、mRNAs表达谱基因芯片分析

目的通过基因芯片分析上皮卵巢癌细胞系中差异表达的Lnc RNAs、m RNAs表达谱,为研究上皮卵巢癌相关Lnc RNAs的功能提供实验依据。方法采用基因芯片分析上皮卵巢癌细胞系A2780、HO8910、SKOV3与卵巢上皮细胞系HOSEpi C中Lnc RNAs和m RNAs的表达差异;对差异表达的m RNAs进行KEGG通路富集分析;用q RT-PCR在上皮卵巢癌细胞系及卵巢上皮细胞系中验证差异明显的6条Lnc RNAs的表达水平。结果基因芯片结果发现在3个肿瘤细胞系中上调的Lnc RNAs有227条,下调的有483条;3个上皮卵巢癌细胞系中差异表达的m RNAs主要富集在PI3K-AKT、m TOR及TNF-α等肿瘤相关通路中(P<0.05);PTPRG-AS1、CCNT2-AS1、XLOC_009869、LINC01138在上皮卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、和OVCR3中表达上调(P<0.05);RP11-252P19.2、RP11-744I24.2在上皮卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO8910、OVCR3和3AO中表达下调(P<0.05)。结论基因芯片筛选出在上皮卵巢癌细胞系中差异表达的Lnc RNAs和m RNAs,差异表达m RNAs与PI3K-AKT、m TOR及TNF-α等肿瘤通路有关,有望为卵巢癌的诊断及治疗提供新的靶点。