色谱技术在肝素结构分析中的研究进展

肝素(heparin,Hp)是目前临床应用最为广泛的抗凝剂,是由重复二糖单元组成的多硫酸化酸性直链多糖。低分子量肝素(LMWHs)是以肝素为原料,经过化学或酶降解获得的相对分子质量相对较小的肝素衍生物,相对肝素,它们的出血副作用和免疫原性更小,皮下注射时生物利用度更高。肝素及低分子量肝素具有一系列结构特点,如相对分子质量偏大且有一定分布,多种糖残基同时存在,硫酸酯位置和数量呈现多样化,以及不同工艺产生的特殊残基的种类和含量不一等。该类药物结构的复杂性对分析方法提出了巨大的挑战,也限制了其质量控制提升、工艺优化、临床用药安全和新适应证拓展等。该文以色谱分析方法为中心,从结构分析的不同角度,包括单糖、二糖、寡糖、多糖的识别、组成分析和不同层次,系统地梳理和阐述近年来肝素类药物在色谱分析方法上的进展,并对这些方法的应用范畴、创新性、局限性等进行总结。该文将为肝素类药物的结构分析、质量控制提供较系统的方法学参考,为更多新方法开发提供思路,为更深入地研究肝素类药物结构、拓展其应用提供有力支撑。

几种糖醛酸及其寡糖的薄层层析分析

以葡萄糖醛酸(G lcA)、半乳糖醛酸(GalA)、甘露糖醛酸(M anA)、古罗糖醛酸(Gu lA)、半乳糖醛酸寡糖(O ligo-GalA)、甘露糖醛酸寡糖(O ligo-M anA)、古罗糖醛酸寡糖(O ligo-Gu lA)和酶解褐藻胶寡糖(O ligo-u-A lg)为研究对象,探讨其薄层色谱(TLC)行为。结果表明,TLC对不同糖醛酸寡糖有良好的分离和分析效果,其中O ligo-GalA与褐藻胶来源的寡糖Rf值不同,而同样来源于褐藻胶的O ligo-M anA与O ligo-Gu lARf值相同;首次发现酸解与酶解褐藻胶寡糖聚合度相同时Rf值不同。此外,4种糖醛酸对不同的显色剂的显色灵敏度也略有不同,其中硫酸铈显色剂的显色效果最灵敏。这些结果为快速有效分析酸性寡糖的纯度及其聚合度,提供了简便有效的方法。

基于Zeta电位表征血小板因子4/依诺肝素钠复合物的方法学研究

目的建立Zeta电位法研究血小板因子4/依诺肝素钠(PF4/Eno)复合物表面电荷的方法,以比较和评价肝素类样品潜在的免疫原性。方法考察不同孵育时间、不同PF4/Eno摩尔比例对PF4/Eno复合物表面电荷的影响,并对方法的精密度和专属性进行分析验证。结果孵育时间在10~30 min时PF4/Eno复合物较为稳定;PF4/Eno复合物的PHR_(ζ=0)值约为12,PF4/Hp复合物的PHR_(ζ=0)值约为48,差异有统计学意义(P<0.001),表明方法具有较好的专属性;日内精密度RSD<8.0%,日间精密度RSD为8.2%,表明方法精密度良好。结论建立的方法可以用于比较和评价肝素类样品潜在的免疫原性,并为依诺肝素钠仿制药的免疫原性一致性评价提供理论和方法上的参考。

寡糖的生物活性及海洋性寡糖的潜在应用价值

寡糖有着多种生物活性,如:抗凝、抗病毒、增强免疫功能、抗肿瘤与抗炎等。它也广泛地应用于保健食品方面。同时,海洋性寡糖在结构与带电性等方面与内源性寡糖有很多相似之处,所以它有着很多潜在的活性应用价值。

一种海洋弧菌(Vibrio sp.WYA)褐藻胶裂合酶降解特性研究

从海洋弧菌（Vibrio sp．WYA）中得到一种褐藻胶裂合酶，将其分别作用于寡聚甘露糖醛酸和古罗糖醛酸纯品（dp5～7）以及褐藻胶，采用HPTLC和FPLC等技术对产物进行分析，并应用ESI-MS和NMR进行结构分析．结果表明，该酶最小识别片段为六糖，终产物主要为三糖，且识别和切割位点为甘露糖醛酸残基．

中性糖对古糖酯含量测定的影响

采用硫酸 -苯酚法、硫酸 -咔唑法和硫酸 -间羟联苯 3种方法分别对古糖酯的含量测定进行了研究 ,并考察了 3种方法中加入 8种单糖即阿拉伯糖 (Ara)、半乳糖 (Gal)、葡萄糖 (Glc)、果糖(Fru)、木糖 (Xyl)、甘露糖 (Man)、鼠李糖 (Rha)和岩藻糖 (Fuc)后对古糖酯含量测定的影响。结果表明 3种方法测定古糖酯含量时 ,其吸收值与古糖酯浓度 (在 0 .1～ 0 .5 mg/ m L 范围内 )都呈良好的线性关系 ,不同的中性糖对 3种测定方法影响不同。样品回收率亦不相同。

古糖酯的稳定性研究

目的 探讨古糖酯的稳定性。方法 本文采用凝胶色谱 (HPGC) ,聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,紫外扫描 ,明胶比浊法来考察古糖酯在高温、高湿、强光照射及加速条件下分子量和分子量分布宽度及样品中硫酸根含量的变化情况。结果 这几种方法适用于古糖酯的稳定性考察 ,在高温 6 0℃和 80℃条件下样品有所降解 ,80℃条件下更为明显 ,其他条件下样品稳定性良好。

青稞多糖对糖尿病模型小鼠的降血糖作用及机制研究

目的:研究青稞多糖(HVP)对糖尿病模型小鼠的降血糖作用及机制。方法:对小鼠腹腔注射链脲佐菌素(120 mg/kg)以复制糖尿病模型。将造模成功的小鼠随机分为模型组、二甲双胍组(阳性对照,200 mg/kg)和HVP高、中、低剂量组(300、150、75mg/kg),另设空白对照组,每组10只。各给药组灌胃相应药物,空白对照组和模型组小鼠灌胃等量水,每天1次,连续30天。给药10、20、30天时测定小鼠的空腹血糖(FBG);末次FBG测定后,小鼠腹腔注射10%葡萄糖溶液(2 g/kg),于注射后30、120 min时测定糖耐受量(GTT)曲线下面积;测定小鼠血清中胰岛素水平和肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的含量;采用苏木精-伊红染色法观察小鼠胰腺组织病理学变化。结果:与空白对照组比较,模型组小鼠FBG、GTT曲线下面积和肝组织中MDA含量均显著升高或增加(P<0.01);血清中胰岛素水平和肝组织中SOD、GSH-Px含量均显著降低(P<0.01);胰腺组织损伤严重,形态不完整,有明显的空泡。与模型组比较,HVP高剂量组小鼠FBG、GTT曲线下面积和肝组织中MDA含量均显著降低或减少(P<0.05或P<0.01),血清中胰岛素含量和肝组织中SOD、GSH-Px含量均显著升高(P<0.05或P<0.01),HVP低、中剂量组上述指标部分改善,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);胰腺组织损伤有所减轻,形态较为完整,胰岛细胞排列紧密,空泡减少。结论:HVP可降低糖尿病模型小鼠的血糖水平,升高胰岛素水平并减轻胰腺组织损伤;该作用机制可能与其抗氧化作用有关。

亲水相互作用色谱-高分辨质谱分析不同糖胺聚糖寡糖

建立了亲水相互作用-液相色谱-质谱联用分析糖胺聚糖类复杂样品的方法。在高分辨质谱联用条件下,流动相5 mmol/L醋酸铵缓冲溶液可有效使用。在此基础上,对不同的色谱柱进行了筛选。其中,氨基亲水相互作用色谱柱对糖胺聚糖类寡糖的分离效果不佳;酰胺基亲水相互作用色谱柱仅适用于透明质酸寡糖的分析,可以有效分离聚合度2~20的透明质酸寡糖;在较高温度下,两性离子基质的亲水相互作用色谱柱可以对聚合度2~30的透明质酸寡糖和聚合度2~12的硫酸软骨素寡糖有效分离;而二醇基亲水相互作用色谱柱对透明质酸（聚合度2~30）、硫酸软骨素（聚合度2~20）以及肝素（聚合度4~20）都适用,并呈现出较好的分离效果。本研究比较了不同类型的亲水相互作用色谱结合高分辨质谱对不同聚合度、不同电荷密度的糖胺聚糖寡糖的分离特点,建立了相应的高效分离和分析方法。本方法有较高的分辨率和质谱适用性。

低聚古罗糖醛酸数均分子量测定方法的研究

分别采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法和高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定了低聚古罗糖醛酸的数均分子量。结果表明:DNS比色法可直接测定低聚古罗糖醛酸的数均分子量,以麦芽糖和古罗糖醛酸标准三糖分别作为标准品,其测定结果相近,该方法准确度高,重复性好;HPGPC法简便易行,可通过测定低聚古罗糖醛酸的重均分子量(Mw)和分子量分布宽度D间接计算数均分子量,该法测定结果与前者结果相比有较大差别,可能与2种方法使用的标准品不同有关。

应用硫酸苯酚法建立一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性检测方法的研究

建立了一种简便快捷的甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性的测定方法。研究发现相同分子质量的聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸与苯酚硫酸试剂反应后显色程度不同,以此可以用来测定β-D-甘露糖醛酸/α-L-古罗糖醛酸(M/G)值的变化,从而计算甘露糖醛酸C-5差向异构酶的活性。利用本方法测定了已知结构的褐藻胶片断的M/G比,其结果与传统的1H-NMR测定值基本一致。

基于Q2(R1)理念的药品质量分析方法验证新概念

分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于检测用途。新的方法验证对各个验证参数同时进行评估,引入了总误差概念,给将来的任何一个单个测试结果落在一定置信区间的可接受标准之内提供证据并核实,使得验证后的方法更具可信度。概括和介绍了新的分析方法验证的目的、实验设计、优点和应用等方面的内容,以帮助大家了解这种分析方法验证的新概念。

液体制剂生产过程中药物含量控制的常见问题分析

液体制剂如大输液、针剂、液体喷剂和口服液等,被广泛用于治疗多种疾病。其成分含量的准确性对于治疗有效与否甚至对患者的生命安全至关重要。在药品生产实践过程中,由于液体制剂的成分含量单位和工艺过程控制单位的不同,以及工艺过程中温度的变化,溶液混合过程中各组分的量总是困扰着工程师和操作人员。以某一实际工艺生产为例,运用溶液混合的基本原理,对不同的产品浓度要求下,溶液配制工艺中的组份在不同单位与温度下进行了计算。此计算与讨论理清了一些易混淆的概念,为制定配制工艺中各组份的质量控制标准提供参考。

一种新的褐藻胶寡糖制备方法——氧化降解法

建立了一种新的褐藻胶寡糖的制备方法 ,即氧化降解法。通过褐藻胶来源的聚甘露糖醛酸 (PM)在不同浓度的过氧化氢、不同温度和不同反应时间下降解优选降解条件。以包含3～11糖单体的寡糖混合物为目标产物 ,以相应的降解产物的平均分子质量为1500u为选择标准 ,获得氧化降解法的最佳条件 :过氧化氢浓度5% ,反应温度90℃ ,降解时间2h。以该条件降解PM获得的降解产物经圆二色谱、紫外光谱及红外光谱测定表明 ,制备的寡糖保持了甘露糖醛酸的结构特点。

HPLC法测定鲁比前列酮有关物质

目的:建立了高效液相色谱法测定具有烯醇互变结构的鲁比前列酮有关物质方法。方法:采用Li Chrospher100 Diol,(250 mm×4. 0 mm,5μm) Merck色谱柱,以正己烷:无水乙醇:冰醋酸(500∶40∶1)的混合溶液为流动相,等度洗脱,检测波长294 nm。结果:在该色谱条件下,各杂质和鲁比前列酮之间的分离度均能达到1. 5以上;各有关物质的检测限为相当于主成分浓度的0. 03%;鲁比前列酮及其有关物质在各自限度范围内线性良好(r≥0. 990,n=6);各杂质的准确度均在95. 0%～100. 0%之间(RSD≤5. 0)。结论:本方法可用于鲁比前列酮有关物质的检测。

酶解褐藻胶寡糖的HPCE分析方法研究

采用高效毛细管电泳法(HPCE)对酶解褐藻胶寡糖进行了分离分析,考察了缓冲液浓度、pH、电压及温度等参数对寡糖分离的影响。实验结果表明在pH=2.5,100mmol/L磷酸盐缓冲液中,运行电压20kV,电泳由负极到正极,温度30℃,235nm紫外检测条件下,酶解褐藻胶寡糖获得了高效分离。

海洋动物来源糖胺聚糖生物活性研究进展

糖胺聚糖具有抗凝、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、神经保护、调节肠道菌群及预防和治疗代谢性疾病等多种生物活性,在生物医药、功能食品及日化用品等领域具有广阔应用前景。我国海洋动物资源丰富,所含糖胺聚糖含量高且结构独特,是糖胺聚糖类新药开发的重要资源。对海洋动物中糖胺聚糖的来源、结构特征、生物活性及潜在应用价值进行综述,以期为海洋动物来源糖氨聚糖的高值化利用提供科学依据。

不同来源肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解作用的研究

目的:探索不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解特性的差异,以及依诺肝素钠精细结构表征,为此类药物的质量控制提供理论依据。方法:考察3种肝素酶Ⅰ在不同条件下对依诺肝素钠的降解特点,并利用离子交换色谱法纯化降解产物,之后进行质谱和核磁共振分析,获得结构信息,从而阐述降解产物组成和降解效率的差异。结果:不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠的降解效果不同。大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ的降解效率要高于来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ,而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ效率最低。经离子交换纯化获得数个寡糖,通过结构确认的1个寡糖组分(ΔUA2S-Glc NS6S-Ido A2SGlcNS6S)在第1和第2种酶的降解产物中没有发现,而在第3种酶的降解产物中始终存在。结论:本文比较了3种不同来源肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠过程中的细微差异,为以肝素酶降解为基础的依诺肝素钠结构研究和质量控制提供了有效支持。