溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达

将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥功能 .根据大肠杆菌偏好密码子合成 Decorsin的基因 ,与 scu PA-3 2 k基因融合在一起 ,构建新的嵌合体基因 dscu PA,并在大肠杆菌中通过 IPTG进行诱导表达 ,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在 .对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质 .用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为 92 0 0 0 IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似 ,且有较强的抑制血小板聚集的功能 .重组蛋白 dscu PA不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 .

抗栓肽(Decorsin)在大肠杆菌中的克隆及表达

将人工合成的寡核苷酸片段进行体外连接 ,得到编码抗栓肽 (decorsin)的cDNA .将此cDNA克隆到表达载体pMAL p2x中 ,经核苷酸序列测定结果正确 .在大肠杆菌TB1中通过IPTG进行诱导表达 ,融合蛋白的表达量为 8%左右 .融合蛋白通过亲和柱一步纯化 ,SDS PAGE显示为一条主要蛋白质电泳条带 .血小板聚集实验表明 ,融合蛋白具有较强的抑制血小板聚集的功能 ,抑制常数IC50为 3 70nmol L .

抗栓肽和尿激酶原(B链)嵌合体的构建与表达

通过基因工程重组技术 ,将抗栓肽 (decorsin)基因与尿激酶的B链即scu PA(B)基因用柔性Linker((Gly4Ser) 3 )融合在一起 ,构建新的嵌合体基因dscuPA(B) ,在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中通过IPTG诱导表达 ,并考察了重组质粒在Rosetta(DE3)plysS在传代中的分离稳定性。该融合蛋白在大肠杆菌中是以包涵体的形式存在 ,对包涵体进行变性及复性后 ,并通过Zn2 + 螯合柱和SP阳离子交换柱进行纯化。质谱分析表明分子量为 33 735kD ,与理论值相符。目的蛋白质的纯度可达90 %。纤维蛋白平板法测得嵌合分子的比活为 90 0 0 0IU mg ,与scuPA 32k的比活相近。体外血小板聚集实验表明融合蛋白有较强的抑制血小板聚集的功能 ,抑制常数IC5 0为 0 31 μmol L。以上这些结果表明 ,该融合蛋白不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 。

酰基辅酶A结合结构域蛋白3在病原微生物复制中的作用

病毒及细菌等病原微生物侵入细胞后,复制过程离不开宿主细胞内的宿主蛋白.近年来研究表明,酰基辅酶A结合结构域蛋白3(ACBD3)可以与一些病原体的蛋白质相互作用,影响病原体微生物在宿主细胞的复制.本文通过总结爱知病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、丙肝病毒、人类鼻病毒以及沙门氏菌侵染宿主细胞时,病毒蛋白质与ACBD3及磷脂酰肌醇4-激酶B(PI4KB)相互作用的研究进展,探讨ACBD3在病原微生物中的作用.

逆转运复合体在病毒生命周期中的作用

逆转运复合体(retromer)作为一种蛋白复合物,参与蛋白质从内体到反面高尔基体的逆向运输或从内体到质膜的回收过程,调节了细胞内货物的丰度及亚细胞分布.近期研究发现,retromer可与一些病毒蛋白相互作用从而影响病毒的生命周期.本文通过总结retromer与丙肝病毒、人类免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、痘苗病毒以及松鼠猴疱疹病毒的相互作用,探讨retromer在病毒侵染中的作用.

黄病毒科和冠状病毒科病毒侵染中的外泌体研究进展

外泌体是一种在细胞间信息传递和物质运输中起重要作用的细胞外囊泡,它携带来源于宿主细胞的蛋白质、脂质和RNA等物质,并对受体细胞的生理状态产生重要影响。黄病毒科病毒如丙型肝炎病毒和冠状病毒科病毒如新型冠状病毒导致的疾病严重威胁人类健康,深入了解黄病毒科和冠状病毒科病毒与宿主的相互作用,对于筛选治疗的细胞靶点以及外泌体疫苗的研究具有重要意义。外泌体在黄病毒科和冠状病毒科病毒感染过程中扮演着非常重要的角色,越来越多的研究表明,外泌体的蛋白质和RNA具有抗病毒效应,病毒可以通过劫持外泌体介导的细胞通讯来损害宿主及促进病毒传播。本文旨在通过总结黄病毒科和冠状病毒科病毒与外泌体相互作用的研究进展,为RNA病毒感染机制及抗病毒研究提供参考。

脂滴在丙肝病毒生命周期中的作用

脂滴是细胞内中性脂的主要储存细胞器。最近许多研究都发现脂滴与丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)有着密切的关系。脂滴对HCV的生命周期发挥着重要作用,影响HCV的感染、复制、组装和分泌一系列生命过程。本文就脂滴在病毒生命周期中的作用的最新进展进行综述。

磷酯酰肌醇-4-磷酸与丙肝病毒相互关系的研究进展

丙型肝炎由丙肝病毒(hepatitis C virus,HCV)引起,流行性很强。HCV主要通过毒品注射、输血或器官移植传播;极少数情况下,HCV通过血透析、母婴垂直传染。少部分感染HCV的患者会产生急性丙型肝炎,而大多数人会转变成慢性肝炎,其中1/3的人群病情逐渐恶化,严重时导致肝癌。除了肝脏病变,HCV感染还会引起其他组织和器官的损害。因此,对于HCV感染机制的研究显得尤为重要。近年来,寻找参与HCV复制的关键性宿主因子已成为研究热点,磷酯酰肌醇-4-磷酸(phosphatidylinositol-4-phosphate,PI4P)就是其中之一。该文将着重介绍PI4P及相关蛋白参与HCV生命周期的研究进展,并简要总结相关的鞘脂和胆固醇的生理功能。

GST pull-down联合质谱筛选丙型肝炎病毒蛋白NS5A结构域Ⅰ的相互作用蛋白

目的对1b型丙型肝炎病毒Con1株的NS5A结构域Ⅰ宿主相互作用蛋白进行鉴定分析,为研究NS5A功能及其参与病毒复制机制提供理论基础。方法构建pGEX-4T-1-Con1-NS5A-35-215质粒,诱导表达GST-Con1-NS5A-35-215融合蛋白并纯化。采用GST pull-down联合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对其相互作用蛋白进行鉴定,并使用OmicsBean在线软件对Con1-NS5A-35-215相互作用蛋白进行GO功能富集分析和信号通路分析。结果在Huh7.5.1细胞裂解液中鉴定到547个潜在相互作用蛋白。GO功能富集分析发现相互作用蛋白主要参与细胞运输、应激反应、凋亡、蛋白泛素化等生物学过程。信号通路分析发现相互作用蛋白主要参与蛋白酶体、糖代谢、氨基酸合成、RNA转运等通路。通过免疫印迹验证了Con1-NS5A-35-215可与ACBD3和Vps35结合。结论 NS5A结构域Ⅰ通过其相互作用蛋白参与多种生物学过程,如调控细胞内运输、应激反应、蛋白稳态等过程。与ACBD3和Vps35相互作用的NS5A的片段缩短为35-215。

COPI相关蛋白在病毒复制中作用的研究进展

COPI主要负责从高尔基体到内质网的蛋白囊泡运输。许多病毒包括RNA病毒和DNA病毒以及反转录病毒会劫持或借助COPI通路和(或)COPI相关蛋白如coatomer,ARF1和GBF1以利于其自身生命活动。本文就COPI相关蛋白在病毒复制中的作用的最新进展进行综述。

丙肝病毒非灵长类同源病毒的研究进展

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)是一种危害人类健康的病原体,感染人体后极易导致慢性肝炎,并能引起肝纤维化或脂肪肝,可能进一步发展成为肝硬化、肝癌等终末期肝病。尽管已被发现20多年,丙肝病毒的来源以及进化途径一直没有确定。与此同时,缺乏合适的动物模型严重阻碍HCV致病机理的研究。从2011年起,随着新型测序技术的应用,多种丙肝非灵长类同源病毒相继被发现,这些研究成果将在研究丙肝病毒来源、进化途径以及相关动物模型建立中起重要作用。

丙型肝炎病毒的宿主限制因子

丙型肝炎病毒（HCV）感染是引起肝脏疾病的一个重要原因,目前大约有1.7亿人慢性感染HCV[1]。HCV是单股正链RNA包膜病毒,属于黄病毒家族。病毒RNA长度为9.6×10^3 bp,编码一个由约3 000个氨基酸组成的多聚蛋白。HCV多聚蛋白可被细胞和病毒蛋白酶酶解成结构蛋白（core、E1和E2）和非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）[2]。

甲病毒蛋白的棕榈酰化研究进展

基孔肯雅病毒等甲病毒是一类有包膜的RNA病毒,主要以蚊虫为媒介,给人类健康和畜牧业生产造成重大损害。棕榈酰化是一种可逆的蛋白翻译后修饰形式。在棕榈酰基转移酶的催化作用下,棕榈酰基共价连接到蛋白的半胱氨酸上,形成硫酯键。棕榈酰化调节蛋白的运输、膜定位以及功能。甲病毒中的非结构蛋白1(nsP1)、TF蛋白等已被证明存在棕榈酰化修饰。修饰不仅影响了这些蛋白的定位,也影响了病毒粒子的包装和出芽释放。本文综述了甲病毒蛋白棕榈酰化的研究进展,包括修饰机制、检测方法和修饰对甲病毒的作用等,并对今后研究中有待解决的问题进行讨论。

比较可表达产生VLP颗粒的CHIKV DNA疫苗和减毒活疫苗在小鼠中的免疫效果

目的比较可表达产生病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的CHIKV DNA疫苗与CHIKV181/clone25减毒活疫苗在小鼠中的免疫应答与保护效果。方法C57BL/6n小鼠分别用CHIKV DNA疫苗20μg以肌肉注射加电转的形式免疫2次,CHIKV181/clone25减毒活疫苗10^(5) PFU以皮下注射的形式免疫2次,阴性对照以50μLPBS皮下注射免疫2次,在每次免疫后的第14 d进行体液免疫和细胞免疫检测。在末次免疫后第4周进行CHIKV Ross攻毒实验。结果CHIKV DNA疫苗免疫后诱导的特异性细胞免疫反应和特异性抗体反应均高于CHIKV 181/clone25减毒活疫苗。在CHIKV Ross致死性攻击后,DNA疫苗与CHIKV181/clone25减毒活疫苗均可保护小鼠免于死亡。结论DNA疫苗20μg与CHIKV181/clone25减毒活疫苗105 PFU均可有效预防小鼠CHIKV感染,但DNA疫苗诱导更高水平的体液免疫反应和细胞免疫反应。

蝙蝠中菊头ACE2蛋白和多个动物ACE2是蝙蝠病毒RaTG13和新冠病毒的功能受体

新冠病毒可能起源于蝙蝠,但是否存在中间宿主以及可能的中间宿主是什么,目前还没有明确答案.来自于中菊头蝙蝠的冠状病毒RaT G13是所有已知冠状病毒中与新冠病毒基因组同源性最高的,被认为可能是新冠病毒的起源.本研究首次报道中菊头angiotensin-converting enzyme 2(ACE2)不仅能介导RaT G13入侵,也能介导新冠病毒入侵,但新冠病毒受体结合区(Receptor binding domain,RBD)与中菊头ACE2的亲和力明显比人ACE2低.随后,本研究评估了来自9个目16个不同物种的ACE2作为RaT G13、新冠病毒以及SARS病毒的入侵受体的可能性,发现7个物种的ACE2能介导所有三种病毒的入侵,提示这三个病毒可能具有较广的宿主范围.另外,本研究发现RaT G13和新冠病毒S蛋白在结合小鼠和穿山甲ACE2时存在明显差异.进一步研究发现病毒S蛋白的第484和498位氨基酸对识别小鼠ACE2至关重要.该研究对深入了解冠状病毒入侵、宿主范围以及病毒宿主共进化的机制具有积极意义.

基肯孔雅病毒宿主因子和限制性因子的研究

基肯孔雅病毒（The chikungunya virus,CHIKV）是近年来重新暴发的甲病毒,主要由埃及伊蚊叮咬传播,可引起基肯孔雅热。由于对该病毒的研究尚不完全,目前缺少针对性的预防和治疗方法。CHIKV具有全球暴发的可能性,是公众健康的潜在威胁。近期的研究已经发现许多CHIKV的宿主因子和限制性因子,本文通过总结这些因子,为今后进一步研究CHIKV与宿主细胞的相互作用以及探索其致病机制提供思路。

肠道病毒71型2C蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)2C蛋白的多克隆抗体并测试抗体的应用效果。方法分析EV-A712C的抗原性,设计合成1条EV-A712C蛋白多肽,偶联钥孔血蓝蛋白KLH作为抗原,免疫新西兰大白兔。ELISA测定免疫效价,达到要求后,收集血清并纯化。利用ELISA、免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光法对纯化后的2C蛋白抗体进行鉴定。结果设计的2C蛋白肽段刺激新西兰大白兔产生了特异性抗体,免疫印迹、免疫沉淀和免疫荧光法证明制备的抗体可特异性识别并结合2C蛋白。结论成功获得了EV-A71的2C蛋白抗体,为进一步研究2C蛋白功能提供了有效工具。

类器官模型在新型冠状病毒感染机制及抗病毒药物研究中的应用

由新型冠状病毒引起的新型冠状病毒肺炎已成为严重的公共卫生问题,发病率和死亡率都很高。为了进一步加强对新冠病毒的认识、探明感染和传播的机制,研究者需要在体外建立SARS-CoV-2的实验模型。类器官作为近几年快速发展的细胞培养系统成为一种理想的研究模型。类器官是胚胎干细胞或诱导多能干细胞一定条件下分化成的多种细胞类型共同组成的迷你器官。它具有培养时间相对较短且不存在伦理道德问题等优点,可以应用于模拟SARS-CoV-2感染。本文介绍了肺、肠、大脑和肝脏等类器官在新冠研究中的应用,简述了不同类器官是如何被SARS-CoV-2感染的,以及通过类器官筛选出的有治疗作用的药物。本篇综述为新冠病毒的研究提供了可借鉴的思路。

新型冠状病毒表面蛋白与其受体蛋白棕榈酰化研究进展

由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已在全球范围内流行2年多。SARS-CoV-2是单股正链包膜RNA病毒,可感染多种哺乳动物。蛋白棕榈酰化是翻译后修饰的一种途径,与蛋白质的定位和转运等有关。SARS-CoV-2的刺突蛋白S、包膜蛋白E及其受体血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)均可被棕榈酰化。本文主要综述有关新型冠状病毒蛋白和受体ACE2棕榈酰化的研究进展,包括S蛋白棕榈酰化的位点、参与这一过程的酶以及其功能,通过对这些内容的整合综述,期望为新型冠状病毒致病机制和治疗策略提供新思路。

甲病毒受体MXRA8和LDLRAD3研究进展

甲病毒是感染人类和动物的重要病原体,该病毒属成员可分为两大类:一类可致关节炎,如基孔肯雅病毒;另一类可致脑炎,如委内瑞拉马脑炎病毒和东部马脑炎病毒。尽管对于甲病毒的研究已开展多年,但甲病毒的侵染机制和宿主抗病毒机制尚未清楚,亦未研制出有效的疫苗和抗病毒药物。近年来,基孔肯雅病毒和委内瑞拉马脑炎病毒的受体基质重塑关联蛋白8(matrix remodeling associated 8,MXRA8)和低密度脂蛋白受体结构域蛋白3(low density lipoprotein receptor class A domain containing 3,LDLRAD3)相继被发现,鉴于这两种受体为最新发现,时效性较强,因此本文就这两种已知受体的研究进展进行总结概述,以期为甲病毒致病机制的进一步研究及相关疾病的预防控制提供新的思路。