实时荧光定量PCR法检测转基因小鼠拷贝数

目的利用实时荧光定量PCR法鉴定转基因小鼠外源基因插入拷贝数。方法以TG-CARK转基因首见鼠为研究对象,选取小鼠的高度保守基因Fabpi为内参,利用绝对定量的实时荧光PCR法鉴定转基因小鼠拷贝数,并与传统的Southern blot方法的定量结果进行比较。结果实时定量PCR鉴定的转基因拷贝数与Southernblot法完全一致,三只TG-CARK首见小鼠的拷贝数分别为1,7,45。结论实时定量PCR技术具有高准确性、高稳定性、高通量和低成本的优点,是比传统杂交技术更好的鉴定小鼠转基因拷贝数的方法。

心脏肌球蛋白重链基因c.1273G>A突变与肥厚型心肌病的关联分析

为研究中国人家族性肥厚型心肌病(HCM)的致病基因突变位点,分析基因型与临床表型的相互关系,文章在1个中国汉族HCM家系中进行心脏肌钙蛋白T(TNNT2)基因、心脏肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC3)基因和心脏β-肌球蛋白重链(MYH7)基因的突变筛查,聚合酶链式反应(PCR)扩增基因功能区外显子片段并对PCR产物进行测序分析。结果表明:在该家系接受调查的7名成员中有4名成员携带MYH7基因c.1273G>A杂合突变,该突变位点位于MYH7基因的14号外显子并使425位的甘氨酸(Gly)转换为精氨酸(Arg)。该突变首次在国内HCM家系中发现,突变携带者的临床表型在家系内部呈现明显的异质性。该家系成员TNNT2及MYBPC3基因未发现突变且正常对照组相同位置未发现异常。MYH7基因是我国家族性HCM的致病基因之一,携带c.1273G>A突变的肥厚型心肌病患者临床表型差异明显,提示可能有其它因素参与了肥厚型心肌病的发展过程。

压力后负荷增高大鼠心肌肥厚向心力衰竭的转变

目的观察单纯腹主动脉缩窄造成的心肌肥厚能否转变成为心力衰竭。方法实验选用8周龄的Wistar大鼠,使用7-0号尼龙线对其肾上腹主动脉进行缩窄手术,造成后负荷性心肌肥厚模型(LVH,n=10),同时设置假手术组(Sham,n=10)和正常组(Con,n=10)作为对照。术后第20周和第38周使用超声多普勒和多导生理仪对大鼠血流动力学进行检测。解剖后取出心脏,计算心脏/体重比,并通过HE染色和天狼猩红染色观察心脏形态和纤维化程度。结果腹主动脉结扎后第20周,LVH组大鼠心室壁肥厚,舒张功能下降(E/Aratio:LVH组:1.0±0.25,Con组:1.6±0.12)。术后38周,左心室壁肥厚程度有所下降,但是心室腔扩大,心脏收缩和舒张功能明显下降(EF:LVH组:44.8±8.42,Con组:70.9±5.19;MaxdP/dt:LVH组:4916±1267.3,Con组:14225±932.1;MindP/dt:LVH组:-3246±1217.3,Con组:-12138±725.2)。腹主动脉缩窄术后的动物心脏重量明显增加(3.58±0.32vs.2.34±0.15),HE染色和天狼猩红染色显示LVH组大鼠在术后38周心脏纤维化明显。结论腹主动脉缩窄造成的后负荷增高动物模型首先出现向心性心肌肥厚,伴以舒张功能下降,进而收缩功能下降,发展为心力衰竭。

HPLC-ELSD法测定欣力胶囊中黄芪甲苷的含量

目的:建立欣力胶囊中黄芪甲苷的含量测定方法。方法:采用 HPLC—ELSD 法测定欣力胶囊中黄芪甲苷的含量,AgilentZOBAX C_(18)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈-水(32:68),流速为1.0 mL·min^(-1),柱温30℃,ELSD 载气流速2.5 L·min^(-1)。结果:黄芪甲苷在2.57～12.85μg范围内有良好的线性关系(r=0.9997),平均回收率(n=6)为98.2%。测定了3个批次欣力胶囊中黄芪甲苷的含量,其含量范围为0.29～0.30 mg·粒^(-1)。结论:陔方法准确,重复性好,为欣力胶囊的质量控制提供了一种检测方法。

针对病毒性心肌炎的细胞凋亡研究

目的探讨柯萨奇病毒致细胞死亡时是否存在凋亡,以及凋亡百分率。方法柯萨奇病毒感染心肌细胞和HeLa细胞以后,应用TUNEL原位标记、DNALadder、Hoechst33258染色和Annexin-V/PI染色观察细胞凋亡发生情况;并通过流式细胞仪分析细胞凋亡发生率。结果Hoechst33258染色发现病毒感染后的细胞核出现强亮度的蓝色荧光,可观察到凋亡细胞的典型变化;Annexin-V/PI染色可见HeLa细胞膜显强绿色荧光,细胞核显强红色荧光;感染组细胞DNA出现阶梯状条带影。通过流式细胞仪检测被PI染色的细胞DNA,发现病毒感染组出现凋亡峰,凋亡率为49.5%。结论柯萨奇病毒致病毒性心肌炎时细胞不仅存在凋亡,而且是细胞主要死亡形式。

病毒性心肌炎细胞感染模型的建立及实验研究

目的:建立病毒性心肌炎细胞感染模型。方法:以柯萨奇B_3病毒感染原代培养的乳鼠心肌细胞,镜下观察心肌细胞搏动次数、细胞病变、测定DNA含量及MTY活细胞染色。结果:采用差速贴壁法获得的活心肌细胞数>90％(台盼蓝染色),心肌细胞多核、多形性特征明显(HE染色);感染CVB_324小时后,心肌搏动频率紊乱,感染48小时至一周后心肌搏动次数明显减少(P<0.01),随后肌丝断裂,细胞圆缩、脱落,细胞病变程度与MTF染色OD值呈明显负相关。细胞周期分析显示细胞受阻于G_1期,有凋亡峰出现。结论:乳鼠心肌细胞原代培养及CVB_3感染方法的建立,可作为研究病毒性心肌炎药物筛选和治疗的重要体外模型。

欣力胶囊对心力衰竭大鼠心肌重塑及心功能的影响

目的:探讨欣力胶囊能否通过抑制心肌重塑以改善心力衰竭(心衰)大鼠的心功能。方法:对20周龄的Wistar大鼠进行腹主动脉结扎手术,20周后,大鼠心功能出现异常。将术后大鼠随机分为实验模型组和3个不同剂量的欣力胶囊治疗组,同时设假手术组,每组12只。灌胃18周后,应用多导生理仪检测各组大鼠的心率、平均动脉压、左心室舒张末压、左心室收缩压上升/下降最大速率(±dP/dt)、等容舒张相时间常数等心功能指标;随后,通过苏木素伊红(HE)染色、天狼猩红染色和丽春红染色对心肌进行组织形态学分析。结果:术后38周通过大鼠血流动力学检测发现,各组大鼠心率、平均动脉压均无统计学差异(P＞0.05)。实验模型组大鼠±dP/dt、等容舒张相时间常数和左心室舒张末压明显改变(P＜0.05),呈现典型的心衰征象。欣力胶囊的3个剂量组均能显著改善上述指标(P＜0.05),且存在明显的量效关系。HE染色、天狼猩红染色和丽春红染色显示,实验模型组大鼠心肌组织中纤维结缔组织增生、纤维化明显,残余心肌细胞肥大、心肌细胞截面积增加,表现为典型心肌重塑改变,欣力胶囊能够缓解上述病理变化。结论:欣力胶囊能够改善腹主动脉结扎导致的心衰,其机制与欣力胶囊抑制后负荷增高引起的心肌重塑有关。

芪红胶囊通过免疫调节治疗病毒性心肌炎小鼠

目的观察芪红胶囊是否通过调节病毒性心肌炎小鼠的免疫系统发挥抗病毒作用。方法实验选用纯系雄性BALB/c小鼠,分组为:正常对照组、假处理对照组、利巴韦林对照组、芪红胶囊高、中、低剂量组,每组均为20只小鼠,腹腔注射10-3TCID50CVB3病毒造成病毒性心肌炎模型,4 h后灌胃给予芪红胶囊进行治疗,以利巴韦林作为阳性对照药物,于第3、6、9、12、15天随机选择每组中的4只动物进行实验。应用SABA18生化分析仪检测小鼠血清中LDH和CK-MB含量;通过芪红胶囊抑制VSV病毒在L929细胞上的毒力,测定芪红胶囊刺激脾细胞产生干扰素的效价;应用固定病毒稀释血清法测定血清中中和抗体浓度,最后取出小鼠心脏,制备心肌组织悬液,检测不同分组心脏组织中CVB病毒滴度。结果芪红胶囊能够显著降低血清中CK-MB和LDH含量(P<0.05),显示心脏受损程度减轻,并呈现量效关系;芪红胶囊具有诱生干扰素的能力,与病毒对照组间存在显著的统计学差异(P<0.05),利巴韦林组刺激干扰素产生的能力非常明显,优于芪红胶囊。此外,芪红胶囊具有刺激机体产生中和抗体的能力。对各组小鼠心肌组织悬液进行病毒滴度测定,发现病毒对照组小鼠的血清中,从第3天开始病毒滴度逐步上升,芪红胶囊药效组能够明显降低血清中的病毒滴度,在5个不同的时期均与病毒对照组存在显著的统计学差异(P<0.05),利巴韦林组也有明显的降低病毒滴度的作用(P<0.05)。结论芪红胶囊能够减少CVB病毒在心肌组织中的繁殖,其机制与芪红胶囊对小鼠免疫系统的调节有关。

HPLC-ELSD测定芪红胶囊中的黄芪甲苷

目的采用HPLC-ELSD法测定芪红胶囊中的黄芪甲苷。方法采用Capcell PAK C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-水(75:25),检测温度115℃,载气流速2.5 ml.min-1,柱温35℃。结果黄芪甲苷能与相邻峰完全分开,进样量1.012~5.06μg与峰面积积分值的线性关系良好(r=0.9998)。结论所建方法简便易行,准确可靠,可用于芪红胶囊中黄芪甲苷的质量控制。

黄芪总提取物对心肌细胞的保护作用及对c-myc基因表达的影响

目的 观察黄芪总提取物在病毒性心肌炎体外细胞培养模型中的药效作用,以及对细胞凋亡调控基因c-myc表达的影响。方法 柯萨奇病毒感染乳鼠原代心肌细胞后于不同时间加入黄芪总提取物和/或病毒,逐日观察心肌细胞搏动次数、细胞病变,MTT染色比较各组间活细胞数的变化,病毒繁殖抑制实验比较TCID50的差别以验证黄芪总提取物的抗病毒活性。实验以盐酸胍作为阳性对照药。应用流式细胞计量术、DNA Ladder分析凋亡发生情况,RT-PCR测定c-myc表达变化。结果 TEA在体外实验中能有效抑制CVB3引起的细胞病变(P<0.01),加药组比病毒对照组TCID50降低两个以上对数值,其药效优于同等浓度的抗病毒对照药物。流式细胞仪检测显示加药组凋亡细胞数目明显减少,RTPCR结果提示黄芪总提取物能下调凋亡早期基因c-myc的表达。结论 黄芪总提取物对体外培养的心肌细胞具有保护作用,其机理可能与下调凋亡调控基因c-myc表达有关。

高效液相色谱-蒸发光散射法测定欣力胶囊中丹酚酸B的含量

目的 测定欣力胶囊中丹酚酸B的含量，建立欣力胶囊的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱．蒸发光散射（HPLC—ELSD）法，Kromsil C18色谱柱（4．6mm×250mm，5μm），流动相甲醇-乙腈-甲酸-水（30：10：1：59），柱温35℃，流速1．0mL·min^-1，检测波长286nm。结果 丹酚酸B在0．1455～0．7275μg范围内有良好的线性关系（r=0．9999），平均回收率为99．04％（n=6）。3个批次欣力胶囊中丹酚酸B的含量范围为每粒0．51～0．52mg。结论 该方法准确，重复性好，为欣力胶囊的质量控制提供了一种检测方法，以利于验证该制剂工艺的可行性。

IC53基因超表达改变系列心衰相关基因表达水平

目的我们于2002年报道了IC53基因在心衰模型中高表达并能促进细胞增殖,为了进一步探讨IC53基因高表达在心衰发展过程中的作用,我们通过基因芯片分析IC53基因超表达引起的心血管疾病相关基因表达水平变化。方法将IC53基因读码框克隆到真核表达载体pCDNA3.1/Myc-His(-)A中并稳定转染ECV304细胞,分别从转染pCDNA3.1/Myc-His(-)A及pCDNA3.1/Myc-His(-)A-IC53的细胞中提取总RNA,分离mRNA,逆转录标记后与购自Clontech的人心血管疾病相关基因芯片杂交,并以Nothern杂交验证。结果IC53超表达能调控系列心血管疾病基因表达水平,显著上调的基因有PDGF-B、Vimentin、Integrinα2、Integrinα4、actinα2、desmoeollin3A/3B、14kDLectin、ecNOS等,显著下调的基因有Fosrelatedantigenl、TFP12、hDLC1、Caveolin1、Caveolin2、Caveolin3、endothelin-conveningenzyme1等。结论IC53基因超表达可以调控一些与内皮功能、炎症反应相关的基因表达,从而参与心衰发展进程。

柯萨奇病毒致病毒性心肌炎分子生物学机理

柯萨奇B组病毒是引起病毒性心肌炎的主要病原之一,有25％VMC患者的确切病因是由CVB感染所致。根据其对新生乳鼠的致病特点,CVB可分为六个血清型,其中CVB3有很强的噬心肌性,在病变心肌组织中发现的CVB3病毒RNA序列已经证实这一点。通过研究CVB3病毒结构蛋白与疾病发病机理之间的关系,以及重组CVB3嵌合病毒与心血管疾病的相关位点,证实CVB3的5’端非编码区对病毒毒力的重要作用;同时证实除诱导心肌炎的病毒可以直接破坏感染细胞外,宿主的自发性免疫反应则使心肌组织进一步损伤,由于心肌纤维化、心肌细胞肥大以及心肌结构重塑,最终导致约15％的VMC患者可逐渐发展成为扩张型心肌病。

新基因C10orf97参与压力超负荷性心肌肥厚

目的检测新基因C10orf97是否参与压力超负荷型心肌肥厚病程。方法通过缩窄大鼠胸主动脉横支构建压力超负荷诱导的心肌肥厚模型,在缩窄手术后的连续时间点应用血流动力学检测评价心室重构和心功能,应用实时荧光定量PCR法检测心肌肥厚标志基因心房利钠肽和C10orf97的mRNA表达。结果主动脉缩窄手术后,大鼠心脏显著肥厚,心脏体重比逐渐增加,心功能先受损后代偿性增强。心房利钠肽表达显著上调,在缩窄后第15天升高为假手术组40倍。C10orf97基因的表达在缩窄后第2天即显著上调为假手术组的2倍,在第4天降低,随后逐渐上升,第15天时表达量升高为假手术组的3倍。结论C10orf97基因参与了压力超负荷引起的心肌肥厚病程。

外周血白细胞计数与脑卒中患者全因死亡的相关性研究

目的探讨外周血白细胞(WBC)计数水平与脑卒中患者全因死亡的相关性。方法 1742例脑卒中患者,根据入院时WBC计数下降、正常和升高分为A(n=66)、B(n=1428)、C(n=248)三组,根据脑卒中亚型分为脑血栓组(n=758),腔隙性脑梗塞组(n=503),脑出血组(n=481)。收集患者入院时的基线资料及采集静脉血标本,检测白细胞、血小板、甘油三酯及总胆固醇等指标,终点事件定义为全因死亡。结果平均随访4.5年后,C组的死亡率显著高于A、B组(P<0.001)。在调整了年龄、BMI等影响预后因素后,以WBC≤10×109/L为基线资料,WBC>10×109/L全因死亡率增高(P<0.001)。基于脑卒中分类分组,WBC计数升高主要在脑血栓和脑出血患者中显著增加死亡风险(P=0.01)。结论白细胞计数升高对脑卒中患者的死亡具有促进作用,主要增加脑血栓患者和脑出血患者的死亡风险。

CX3CR1基因多态性与冠心病关联的荟萃分析

目的 探讨CX3CR1-V249I、T280M与冠心病（CAD）的关联性。 方法 检索中英文数据库，以得到CX3CR1-V249I、T280M与CAD易感性关系的病例对照研究，采用Meta分析方法合并V249I、T280M与CAD关联的OR值，同时进行文献发表偏倚检验。结果 共纳入文献6篇。对于V249I，共纳入病例1551人，对照1804人，I型相对于V型合并OR=0.85（95%CI=0.67-1.08，P〉0.05）；对于T280M，共纳入病例1555人，对照1801人，M型相对于T型合并OR=0.82（95%CI=0.70-0.96，P〈0.05）。结论 T280M为CAD的保护性因素，V249I与CAD的发生无关联。

欣力胶囊对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用

目的观察欣力胶囊对阿霉素(ADR)中毒心肌细胞的保护作用并探讨其机制。方法采用新生SD乳鼠心肌细胞做原代培养,复制ADR损伤心肌细胞模型,测定培养上清液多项生化指标,并运用流式细胞仪检测凋亡细胞。结果ADR(终浓度为10^(-6)M)可致上清液乳酸脱氢酶(LDH)释放量增加(P<0.01),同时细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力下降而丙二醛(MDA)含量升高(P<0.01),欣力胶囊(0.025～0.1 mg/mL)可呈浓度依赖性地降低LDH活力,增加细胞SOD活力和降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。流式细胞仪检测欣力胶囊能降低心肌细胞凋亡率,证实了欣力胶囊的保护作用。结论欣力胶囊能够拮抗ADR引起的自由基脂质过氧化,从而保护心肌细胞。

TNNT 2基因突变致肥厚型心肌病的临床特点及预后分析

目的既往的研究提示TNNT 2基因突变导致肥厚型心肌病(HCM)患者容易发生心源性猝死(SCD),本研究旨在明确中国HCM患者TNNT 2基因突变谱及TNNT 2基因突变阳性患者的临床表型及预后特点。方法采用全外显子测序及panel二代测序对1418例HCM患者进行致病基因筛查,分析携带TNNT 2基因突变患者的临床表型;并结合长期随访结果,分析其预后特点。结果基因检测共发现47例(3.3%)HCM患者携带27个TNNT 2致病基因突变。与未携带TNNT 2基因突变的患者相比,携带TNNT 2基因突变的患者的左心房内径更大(t=2.13,P<0.05),最大左心室流出道压差更低(t=-3.69,P<0.05),且心脏磁共振检查呈弥漫性纤维化的比例更高(χ^2=4.94,P<0.05)。在随访期间,携带TNNT 2基因突变的患者共出现4例心血管病死亡,其中1例为SCD,2例为心力衰竭相关性死亡,1例为缺血性卒中后死亡。携带TNNT 2基因突变的患者发生心血管病死亡的风险与未携带TNNT 2基因突变的患者相比差异无显著性(P=0.57)。结论中国HCM患者TNNT 2基因突变阳性率约为3%,携带TNNT 2基因突变的HCM患者的预后与未携带TNNT 2基因突变患者相比差异无显著性。TNNT 2基因突变不能作为HCM患者危险分层的危险因素。

正交试验优选芪红胶囊中苦参提取工艺的研究

目的:优选芪红胶囊中苦参的醇提取工艺。方法:以苦参碱含量为考察指标,采用L9(34)正交表分析提取时间、提取次数、乙醇浓度、乙醇加入量4个因素对提取效果的影响。结果:最佳醇提工艺为70%乙醇提取2次,每次3 h,第一次加12倍量,第二次加8倍量。结论:本文优选的醇提工艺最大限度保留了药用有效成分,并节约了时间和成本,适合工业生产的需要。