载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响

背景:水凝胶材料支架是三维培养细胞的理想材料之一,但水凝胶内部密集的网络结构对细胞增殖及舒展有明显抑制作用,水凝胶支架内部的多孔结构对上述问题有明显改善。目的:探讨以甲基丙烯酸酐化明胶为支架材料、聚环氧乙烷溶液为造孔剂构建三维载细胞多孔水凝胶支架的方法,以及多孔水凝胶支架对细胞行为的影响。方法:制备甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液,将二者分别以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1的体积比混合,加入骨髓间充质干细胞,设计构建可载细胞的三维多孔水凝胶支架,表征支架的微观形貌与力学性能,利用活死染色观察细胞相容性、细胞骨架染色观察细胞形态。结果与结论:(1)扫描电镜下可见,各组支架截面呈均匀分布的多孔结构,各孔隙之间相互连通,孔隙呈类椭圆形或类圆形,随着聚环氧乙烷溶液比例的增加,支架的孔径及孔隙率增加;(2)多频应变曲线显示,各组支架的应变均可达到40%以上,其中体积比1∶1支架的应变可达到60%;随着聚环氧乙烷溶液比例的增加,支架的储能模量下降,其中体积比1∶1支架的力学强度较差,仅能勉强维持支架的形态;(3)体外培养14 d的活死染色显示,各组支架内的细胞存活率均>85%;(4)体外培养14 d的细胞骨架染色显示,体积比3∶1支架中大部分细胞呈短梭形,体积比2∶1、1∶1支架中的细胞呈星形或长梭形,细胞间建立了广泛的连接;(5)结果表明,三维载细胞多孔水凝胶支架有利于骨髓间充质干细胞的舒展和增殖,其中体积比为2∶1的支架兼顾了力学强度及生物学性能,是较为理想的三维细胞培养平台。

不同切角方柱斜切体驰振压电能量收集研究

通过风洞实验,针对带有不同斜切角度方柱斜切体(θ=30°、45°、60°)和光滑方柱的驰振压电俘能器的俘能特性,如电压输出响应进行了研究,并分析了输出功率和电压在不同风速下的变化规律。结果表明:在系统所辨识出的最优负载R=0.6 MΩ下,带有光滑方柱和方柱斜切体(θ=30°、45°、60°)驰振压电俘能器的输出电压和功率均随风速的增大而增大,且增长率均呈现出先增大后减小的趋势;同时,采用光滑方柱作为振动钝体的输出电压和功率均大于方柱斜切体。在风速为U=3.194 m/s时,光滑方柱驰振压电俘能器收集到的输出功率为0.0063 mW,分别是斜切角θ为30°、45°和60°的方柱斜切体的1.28倍、1.39倍和1.55倍;在相同风速下,斜切体中斜切角度θ为30°的方柱斜切体输出电压和功率最大,θ为45°时次之,θ为60°时最小。该研究可以为相关压电俘能器的设计和工程中减振的设计提供借鉴。

成软骨相关miR-4287调控人软骨细胞聚蛋白多糖酶-1表达的研究

目的探讨成软骨相关miR-4287对人软骨细胞聚蛋白多糖酶-1(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif 4,ADAMTS4)调控作用及其机制。方法取自愿捐赠的膝关节正常及骨关节炎软骨组织,采用实时荧光定量PCR检测miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达量;然后分离培养软骨细胞,取第1代骨关节炎细胞,给予IL-1β处理,观察其对软骨细胞miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达的影响;分别给予MAPK信号通路抑制剂SP600125以及NF-κB信号通路抑制剂SN50预处理后联合IL-1β刺激,观察IL-1β介导的信号通路对软骨细胞miR-4287和ADAMTS4 mRNA表达的影响;分别转染miR-4287模拟物及其阴性对照、miR-4287抑制物及其阴性对照,观察miR-4287调控软骨细胞ADAMTS4 mRNA及蛋白的表达。荧光素酶报告实验验证miR-4287与ADAMTS4 mRNA 3’非翻译区(untranslated region,UTR)的直接结合效应。结果与正常软骨组织比较,骨关节炎软骨组织miR-4287相对表达量下降,ADAMTS4 mRNA相对表达量上升,比较差异有统计学意义(P<0.05)。IL-1β下调软骨细胞miR-4287表达、上调ADAMTS4 mRNA表达,与未经IL-1β处理的软骨细胞相比差异均有统计学意义(P<0.05)。经IL-1β介导的信号通路抑制剂预处理后,软骨细胞miR-4287相对表达量上升,ADAMTS4 mRNA相对表达量降低,与未经信号通路抑制剂预处理细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染miR-4287模拟物后,软骨细胞内ADAMTS4 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05);而转染miR-4287抑制物后,软骨细胞内ADAMTS4 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05)。无论结合位点为野生型或突变型,过表达miR-4287均不能改变报告载体的荧光素酶活性(P>0.05)。结论成软骨相关miR-4287可能是一种与软骨退变相关的miRNA。miR-4287能调控人软骨细胞ADAMTS4表达,但不是通过靶向结合mRNA 3’UTR的方式发挥作用,其具体机制有待进一步研究。

微小RNA-4287调控人软骨细胞聚蛋白多糖酶-2表达的研究

目的探讨微小RNA(miRNA,miR)-4287对人软骨细胞聚蛋白多糖酶-2(ADAMTS5)的调控作用及其机制。方法从膝关节软骨组织中分离得到软骨细胞,白细胞介素(IL)-1β诱导软骨炎症模型,过表达或抑制细胞中miR-4287水平,实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)及蛋白质印迹法(Western blot)分析miR-4287和ADAMTS5 mRNA及蛋白表达,双荧光素酶报告基因方法验证miR-4287与ADAMTS5 mRNA 3’非翻译区(UTR)的结合效应。结果miR-4287在人骨关节炎(OA)软骨组织中表达较正常软骨组织减少(0.354±0.167比1.074±0.507;t=3.010,P<0.05),而ADAMTS5 mRNA表达升高(21.019±7.044比1.902±2.081;t=-5.820,P<0.01)。与未刺激组比较,IL-1β刺激软骨细胞12 h后,miR-4287表达降低(0.454±0.095比1.010±0.166;t=11.410,P<0.01),而ADAMTS5 mRNA表达增多(5.067±0.994比1.006±0.137;t=7.306,P<0.05)。转染miR-4287模拟物48 h后,软骨细胞内ADAMTS5 RNA(0.620±0.366比1.023±0.269;t=6.047,P<0.05)和蛋白表达均降低;而转染miR-4287抑制剂后,软骨细胞内ADAMTS5 RNA(2.502±0.625比1.018±0.226;t=5.637,P<0.05)和蛋白表达均升高。结合位点为野生型时,过表达miR-4287能降低报告载体的荧光素酶活性(0.789±0.088比1.018±0.226;t=2.806,P<0.05);结合位点突变后,过表达miR-4287能则不能改变报告载体的荧光素酶活性(1.000±0.006比1.014±0.065;t=0.364,P>0.05)。结论miR-4287是人软骨细胞ADAMTS5表达的直接调控因子,可能在软骨基质代谢稳态维持方面具有重要的作用。