类甲基转移酶3通过促进叉头框蛋白O3的N6-甲基腺苷修饰及其表达参与糖尿病诱导的内皮细胞凋亡

目的探讨类甲基转移酶3(METTL3)通过促进叉头框蛋白O(FOXO)3的N6-甲基腺苷修饰(m6A)及其表达参与糖尿病诱导的内皮细胞凋亡的机制。方法构建晚期糖基化终末产物(AGE)诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)损伤模型,将HAEC分为6组:细胞对照组、细胞AGE组、细胞对照+阴性对照小干扰RNA(siRNA)组、细胞AGE+阴性对照siRNA组、细胞AGE+FOXO3 siRNA组、细胞AGE+METTL3 siRNA组,每组设置3个平行组。采用甲基化RNA免疫沉淀测序(MeRIP-Seq)及生物信息学技术检测并分析其m6A修饰谱,采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)检测FOXO3 mRNA的m6A修饰水平,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测FOXO3 mRNA表达水平,Western blotting法检测FOXO3和METTL3蛋白水平。6只6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠按随机数字表法分为单纯动脉粥样硬化组和糖尿病动脉粥样硬化组,每组均为3只。通过Western blotting检测小鼠FOXO3、METTL3蛋白表达,采用免疫荧光共定位检测小鼠FOXO3、METTL3在内皮细胞中的表达。采用两独立样本t检验进行组间比较。结果与细胞对照组相比,细胞AGE组的总m6A修饰及FOXO3的m6A修饰显著升高(P<0.001),FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高(P<0.05)。与单纯动脉粥样硬化组相比,糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域内皮细胞的FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高(P<0.05)。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比,细胞AGE+FOXO3 siRNA组的凋亡显著降低(P<0.01)。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比,细胞AGE+METTL3 siRNA组FOXO3的m6A修饰(P<0.001)及FOXO3蛋白表达均显著下降(P<0.05),且凋亡显著降低(P<0.001)。结论AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化,METTL3通过促进FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达,从而参与糖尿病诱导的血管内皮细胞凋亡。