改良CTAB法对山茶属植物基因组DNA提取的比较研究

山茶属植物体内酚类、多糖等次生代谢物质含量较高,获得高纯度的总DNA比较困难。为筛选出适宜山茶属植物基因组DNA的较优提取方法,并研究不同材料处理方法的差异,采用四因素三水平的正交设计,对山茶属植物基因组DNA的提取方法 CTAB法进行优化。最后确定较优提取方法为:老叶用CTAB-free去除多糖并防止酚氧化,用2%CTAB、2%PVP、24∶1抽提2次;嫩叶用2×CTAB去除多糖并防止酚氧化,用1%CTAB、2%PVP、24∶1抽提1次,并用ISSR-PCR检测。结果显示采用优化方案提取的DNA质量更好,能较好地溶于TE,可用于ISSR-PCR扩增,且扩增出清晰的条带。

正交设计优化硬叶兜兰SSR-PCR反应体系

以构建珍稀物种硬叶兜兰SSR-PCR反应体系,采取正交设计试验对硬叶兜兰SSR体系组分中的Mg2+、基因组DNA、DNA Taq聚合酶、dNTPs、引物5个因素在4个不同程度上进行了组合试验,之后对反应体系中该引物的退火温度在梯度PCR仪上筛选,并进行了最优体系的验证。试验结果显示:体积为10μL的PCR管中最优组合为:模板DNA 20ng,Mg2+3.0mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,引物0.8μmol/L,Taq酶0.8U,10×buffer(Mg2+Free)1μL,引物PR710的退火温度为59.6℃,说明该体系具有较好的实用性。

部分兜兰属植物基于ITS基因的序列分析

本研究以兜兰属4个品种为实验材料,对其进行ITS-PCR扩增及测序,并分析其亲缘关系。登入GenBank NBCI数据库进行序列比对,证实为其ITS序列;4个兜兰属品种的ITS序列长度在770～805 bp之间,其中ITS1的序列长度为283～284 bp,ITS2的序列长度为215～257 bp;4个品种共存在157的变异位点,其中ITS1和ITS2的变异位点数较多,5.85区域变异位点较少;4个兜兰属品种的(G+C)含量在49.22%～51.30%之间,其中硬叶兜兰的(G+C)含量最高,长瓣兜兰的(G+C)含量最低。研究认为,ITS基因对植物系统研究、植物资源鉴定有着重要意义,为兜兰属植物亲缘关系和种质资源的鉴定,以及兜兰属植物的保护方面提供了科学依据。

cpDNA psbA-trnH在硬叶兜兰分子进化中的应用价值

cpDNA psbA-trnH基因被认为是被子植物叶绿体基因组中变异位点最多的序列和进化速率最快的叶绿体间隔子之一,该序列可运用于药材种或品种、产地鉴定、系统进化分析。为了更好地了解兜兰属植物的特征和系统进化研究价值,本研究通过建立硬叶兜兰PCR扩增反应体系,对其叶绿体转录间隔基因(psbA-trnH)扩增效果和测序变异进行研究。结果表明,采用60 ng/10μL的DNA模板、2.5 mmol/L的MgCl_(2)、各0.5μmol/L的引物浓度、0.6 U/10μL的DNA聚合酶和0.3 mmol/L dNTPs,退火温度为58.8℃的反应体系有较好的扩增效率,平均测序成功率为53.03%。该基因长度为684~955 bp,平均长度为835 bp,长度变异系数为9.32%,共检出49个核苷酸变异位点,该基因在种水平的变异较小,在亚科间有不同程度的变异。硬叶兜兰的psbA-trnH序列在居群水平上表现出一定的变异,但平均测序成功率不高,仅为53.03%,在一定程度上限制其应用。