2020-2022年湖南省鼠类钩端螺旋体病监测与菌株分型

目的初步了解湖南省钩端螺旋体病主要宿主动物鼠类的流行病学概况及分离菌株血清学和MLST基因型特征。方法2020-2022年在湖南省湘潭、涟源、双峰及浏阳4个钩体病监测点,开展鼠种构成调查、钩体分离培养、菌株鉴定工作。采用暗视野显微凝集试验(Microscopic agglutination test,MAT)对分离菌株开展血清群鉴定。利用MLST(Multilocus sequence typing)方法开展基因分型分析,分别对7个位点(glmU、pntA、sucA、tpiA、pfkB、mreA和caiB)进行普通PCR扩增、测序、序列分析。结果4个湖南钩体病监测点共捕啮齿类和食虫目动物461只,平均鼠密度为2.52%,共分离菌株56株,来源于黑线姬鼠、黄胸鼠和鼩鼱3个种类,钩体分离率是12.15%。湖南省4个监测点以黑线姬鼠为优势鼠种,占88.72%。经MAT鉴定显示:56株湖南钩体分离株隶属于黄疸出血群和澳洲群两个血清群,黄疸出血群为当地主要流行血清群,占94.64%。MLST分型结果显示:56株湖南省分离株ST型别包括ST1、ST128和ST1053个基因型,其中ST1(57.14%)和ST128(37.50%)为湖南主要流行ST型。利用BioNumerics软件进行UPGMA聚类分析显示:56株菌株被分为3个不同Clades,分别对应3个不同ST型,ST型分布在不同动物种类和地域上呈现明显差异。结论黄疸出血群、ST1和ST128为湖南省主要流行型别,初步了解湖南省钩端螺旋体病鼠类动物流行病学概况及流行菌株分子分型特征,对湖南省钩体病的防控和疫苗制备提供科学依据。

2016-2018年江西省钩端螺旋体病鼠类动物流行病学调查与分离菌株鉴定

目的初步了解江西省钩端螺旋体病主要宿主动物鼠类种类构成、带菌率及血清学和分子流行病学特征,为钩体病的防控提供科学依据。方法2016-2018年选取江西省钩体病4个国家级监测点上饶、上高、上犹及浮梁县作为现场监测地点,开展鼠类种类调查、钩体分离培养工作。利用暗视野显微镜凝集试验和MLST技术对分离菌株进行血清学鉴定和MLST基因分型。结果共计捕鼠14387只,平均鼠密度为9.76%,分离菌株64株,鼠类钩体分离率为4.56%。鼠种构成包括黑线姬鼠、褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠及社鼠5个种类。4个监测点优势鼠种均以黑线姬鼠和黄毛鼠为主。血清群鉴定结果显示:64株菌株隶属于3个血清群,其中黄疸出血群为主要优势血清群,占81.25%,其次是爪哇群和致热群。MLST研究显示:64株菌株隶属于6个ST型别,分别为ST1、ST17、ST92、ST143、ST216和ST224,其中ST1为主要基因型,占76.56%。BioNumerics软件分析显示:64株菌株隶属于6个Clusters,分别对应6个ST型,血清学、MLST基因型分布具有明显地域差异。结论江西省以黑线姬鼠和黄毛鼠为优势鼠种,黄疸出血群和ST1为江西省钩体病主要流行型别,充分了解江西省钩体病可能的宿主动物以及血清学和分子流行病学特征,对钩体病的预防控制有一定的指导意义。

江西省致病性钩端螺旋体血清学和分子流行病学研究

目的对2013年以来江西省致病性钩端螺旋体进行血清学、基因分型分析,以了解江西省钩端螺旋体血清学和分子流行病学特征。方法对27株钩端螺旋体进行暗视野显微镜凝集试验确定血清群。PCR扩增16SrRNA基因、测序,确定基因种。利用MLST(multilocus sequence typing)研究进行基因分型分析,并应用BioNumerics(Version5.10)软件进行聚类分析。结果血清群鉴定:27株菌株隶属于4个血清群,其中黄疸出血群为主要优势血清群,占59.26%,其次依次是爪哇群25.92%、澳洲群7.41%和巴达维亚群7.41%。基因种鉴定:27株菌株隶属于L.interrogans和L.borgpetersenii 2个致病性基因种,L.interrogans为江西省主要优势型别,占77.78%。MLST研究显示27株菌株隶属于5个ST型别,其中ST1为主要基因型,占59.26%。BioNumerics软件分析:27株菌株分为5个Clusters对应于5个ST型,MLST基因型别具有明显的地域性特征,而年代间变化不明显。结论黄疸出血群为江西省主要流行血清群,L.interrogan为主要致病基因种,ST1为主要基因型,充分了解江西省钩体病血清学和分子流行病学特征将对钩体病防控和疫苗制备有一定的指导意义。

多位点序列分型应用于致病性黄疸出血群钩端螺旋体分析

目的初步探讨MLST(multilocus sequence typing)分型技术在致病性钩端螺旋体中的应用。方法对我国3个省份的39株致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取DNA,采用7个位点进行PCR扩增、序列测定,应用eBURST和BioNumerics(Version5.10)软件进行分析。结果 39株菌株呈现5个ST型别,ST1为中国三省份中主要的基因型,占53.85%(21/39)。eBURST分析显示:39株菌株分为2个Clonal complexes和1个singleton,其中Group1占66.67%(26/39),Group2占20.51%(8/39),一个singleton占12.82%(5/39);BioNumerics软件聚类分析显示:39株菌株分为3个Group,与eBURST分析中的分群结构一致。MLST基因型别具有明显的地域性特征。结论 MLST方法可初步应用于致病性钩端螺旋体分子流行病学、种群结构、亲缘进化关系等研究。

霍乱弧菌基因表达分析中内参基因的选择

目的确定不同实验条件下基因表达分析中的稳定内参基因。方法以霍乱弧菌O1群El Tor菌株为研究对象,利用qRT-PCR方法比较不同pH值(pH 8.0、pH 5.5)以及不同温度(37℃、30℃)等多种生理、外界环境模拟培养条件下,thyA、recA、rpoA、gyrB、16SrRNA以及VCA0862 6个候选内参基因的表达水平,利用geNorm软件评价其稳定性。结果不同培养条件下,6个候选内参基因表达水平存在差异。不同pH值条件下最佳基因是recA;不同温度条件下最佳基因是gyrB;不同pH值及温度综合评价时,最佳基因是recA。结论本研究评价和提出了细菌基因表达分析中内参基因筛选的重要性,不同实验条件下最稳定内参基因是不同的,针对不同条件下的基因转录定量分析,应分别对内参基因稳定性进行评价并选择最稳定基因。

贵州省3株钩端螺旋体分离株PFGE分型与基因种鉴定

目的应用脉冲场电泳(PFGE)分型技术和16S rRNA基因测序分析技术分别对贵州省3株动物宿主钩端螺旋体分离菌株进行分子分型和基因种鉴定,了解贵州省钩端螺旋体的分子流行病学特征。方法应用DNA限制性内切酶NotI对钩端螺旋体染色体DNA酶切后,用PFGE将DNA片段分离,采用BionumericsV4.0将3株钩体菌株PFGE图谱与中国15群15型参考菌株进行聚类分析;同时,应用PCR扩增几乎全长的钩体16S rRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,并与GenBank数据库已注册的核酸序列进行同源性比对、确定基因种、分析亲缘进化关系。结果来自贵州省的3株动物宿主分离钩体菌株PFGE带型命名为LepNot I 002和LepNot I 003,经聚类分析,3株菌株与黄疸出血群黄疸出血型赖株的相似性大于95%。16S rRNA基因测序和分析表明,3株贵州分离钩体菌株之间的同源性为100%,与致病性钩体问号钩端螺旋体种(L.interrogans)不同血清型参考菌株的同源性达100%。结论 3株贵州动物分离钩体菌株经PFGE分型鉴定与黄疸出血群赖型赖株的相似性大于95%,经16S rRNA基因测序分析鉴定为L.interrogans种,上述两种方法对贵州省钩体分离菌株的鉴定结果一致,有助于贵州省钩端螺旋体病的主动监测、暴发调查和传染源追踪。

贵州省2011年黑线姬鼠钩端螺旋体分离株16S rRNA基因序列分析及基因种鉴定(英文)

目的了解贵州省钩端螺旋体病(简称钩体)病原学特征,分析2011年贵州省钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株16SRNA基因序列并对其进行基因种鉴定,为贵州省钩体病的有效预防和控制提供科学依据。方法应用PCR扩增几乎全长的钩体16SrRNA基因片段,并将扩增产物进行双向序列测定,从NCBI数据库下载钩体17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体16SrRNA基因序列,采用生物信息软件比较分离株和各基因种代表株间的核苷酸序列,分析其亲缘进化关系,确定分离株基因种。结果通过PCR扩增和基因测序技术获得4株钩体分离株16SrRNA基因核苷酸序列(1492bp),4株钩体分离株的核苷酸同源性为100%,与17个钩体基因种中的问号钩体(L.interrogans)基因种黄疸出血群代表菌株的同源性最高(99.9%),系统进化树分析显示,钩体分离株与17个基因种代表菌株及伊尼利螺旋体和短小螺旋体形成致病性、非致病性、未知致病性和其它分支,贵州4株分离株分属于致病性基因种分支,其中与致病性钩体8个基因种中的问号钩体基因种亲缘关系最近。结论贵州省2011年钩体病疫区黑线姬鼠钩体分离株均属致病性钩体的L.interrogans基因种,该基因种菌株可能为当地流行菌株,该结果将为贵州省钩体病的预防和控制提供科学依据。

环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

目的利用环介导等温扩增技术,建立检测钩端螺旋体的方法。方法选取钩体LipL32基因,设计了LAMP引物。对27株钩体、25株非钩体样本予以检测,然后进行灵敏度和模拟样本的研究。结果扩增27株钩体结果为阳性,扩增25株非钩体结果为阴性。灵敏度为200拷贝/μL,模拟样本检测下限为200条钩体/μL(煮沸法)和20条钩体/μL(试剂盒提取法)。结论 LAMP实验操作简单,对设备要求不高,可以作为钩体的快速检测方法。

问号钩端螺旋体重要蛋白研究进展

钩端螺旋体(简称钩体)外膜蛋白(outer membrane proteins,OMPs)位于钩体表面,与宿主细胞直接接触,是重要的蛋白抗原。钩体OMPs是抗体和补体的作用部位,在致病和免疫应答过程中起重要的作用。一些钩体的外膜蛋白或外膜脂蛋白被证实有良好的抗原性和高度的基因保守性,其抗体具有广泛的交叉免疫凝集作用,这使得新一代基因工程疫苗开发成为可能。本文主要对钩端螺旋体几种重要OMPs的细胞定位、基因结构、在感染动物中的表达状态、在免疫保护中的作用等进行综述。

形体与空间——绿地东海岸国际广场设计的解读和思考

本文从建筑形体和视觉空间的角度入手,结合绿地东海岸国际广场的设计案例,剖析当代大型综合体建筑的设计理念,解读形式与功能、立面与构造之间的关系。

4种中国常见致病性基因种钩端螺旋体标准菌株的建立与评价

目的依据《病原微生物菌(毒)种国家标准株评价技术标准》(WS/T 812—2022),建立Leptospira interrogans、L.borgpetersenii、L.alexanderi和L.weilii 4种中国常见致病性基因种钩端螺旋体标准菌株。方法以56601、56604、56615、566554株致病性代表菌株为研究对象,利用暗视野显微镜开展形态学观察。以16S rRNA基因为靶基因进行聚合酶链式反应扩增、测序确定所属基因种。通过多位点序列分型(MLST)方法,对4株代表株进行分子分型分析,确定每株菌株7个位点等位基因号和序列型别(ST)。综合暗视野显微镜形态学观察、16S rRNA基因测序和MLST分型结果系统评价4株代表菌株经不同传代次数后的分子遗传学稳定性。同时通过Illumina NovaSeq测序平台对56604、56615和56655开展全基因组测序分析,了解菌株基因组特征。结果暗视野显微镜下,4株代表菌株均具有典型的钩端螺旋体形态。16S rRNA基因序列分析显示,56601、56604、56615和56655分别隶属于L.interrogans、L.borgpetersenii、L.alexanderi和L.weilii 4种不同致病性基因种。MLST分型结果显示4株代表株隶属于4种不同ST型。4株代表株在亲代株及在体外连续传代一定代次后,暗视野显微镜下形态不变,所属基因种和MLST基因型结果一致,证明该4株代表株具有良好的分子遗传学稳定性。基因组测序分析显示,4株代表株基因组大小为3.93~4.69 Mb之间,G+C含量为36.00%~40.87%。结论初步建立并评价了4种中国常见致病性基因种钩端螺旋体标准菌株,为钩端螺旋体病的疾病控制、临床诊断、教学科研、疫苗研发提供菌株资源。

2021年贵州省环境致病性钩端螺旋体分离培养及基因种分析

目的对贵州省2021年钩端螺旋体(钩体)病疫区环境标本进行致病性钩体分离培养,了解其基因种特征,为钩体病防控提供科学依据。方法采集钩体病疫情发生地环境水和土壤样品,采用EMJH培养基进行钩体分离培养。提取疑似钩体生长培养物基因组DNA,采用致病性钩体特异性PCR进行检测,同时采用16S rRNA序列分析法对其进行基因种鉴定,并应用MEGA 7.0软件构建系统发育树,分析菌株间进化关系。结果从112份环境样品中分离出50株疑似钩体菌株,致病性钩体特异性PCR检测显示其中3株为致病性钩体,包含环境水样分离出的2株和土壤样品中分离出的1株。16S rRNA序列比对分析显示,经PCR检测为致病性钩体的3株菌株属于钩体致病性基因种,其中2株为Leptospira noguchii基因种,1株为Leptospira borgpetersenii基因种;另外47株菌株中5株菌株属于钩体中间种,42株菌株属于钩体非致病性基因种。系统发育树显示,致病性钩体菌株与其基因种代表性菌株进化关系较近。结论贵州省钩体病疫区环境钩体基因种复杂,同时存在致病性基因种和非致病性基因种,本次检出的2种致病性钩体基因种为贵州省尚未报道的基因种,可为贵州省钩体病疫情防控提供科学依据。

黄疸出血群钩端螺旋体MLVA分型研究

目的初步探讨MLVA（multiple—locus variable—number tandem-repeat analysis）技术在黄疸出血群钩端螺旋体基因分型中的应用。方法选取7个VNTR位点，对我国致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取基因组DNA，采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳技术检测，应用BioNumerics（Vetsion4．0）软件进行聚类分析。结果共对117株钩端螺旋体的7个VNTR位点进行了检测，聚类分析分为3个群（A群、B群、C群）28种基因型，其中A群占11．97％（14／117）、B群占0．85％（1／117）、C群占87．18％（102／117）；多态性指数介于0．0831与0．8005之间；MLVA基因型存在明显的地域性。结论MLVA分型技术可初步对钩端螺旋体进行遗传学分类鉴定，应用该技术，将在钩体病分子流行病学研究中发挥重要的作用。

致病性钩端螺旋体TaqMan Real-timePCR检测技术的建立及其应用

目的建立致病性钩端螺旋体（钩体）TaqManReal-timePCR检测技术。方法以钩体16SrRNA基因的部分片段rrs基因作为靶基因，设计引物、TaqMan探针，PCR产物克隆到pMDl9-T载体，制作标准曲线，建立定量分析质控标准。利用中国15群15型致病性钩体参考菌株、16群21型非致病性钩体参考菌株、50株不同血清群致病性分离株及伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等27株其他常见致病菌检验引物、探针的灵敏性、特异性。将Real-timePCR、普通PCR同时应用于倍比稀释致病性钩体染色体DNA及25份现场鼠肾标本的检测。结果建立、优化致病性钩体Real-time PCR技术，致病性钩体扩增荧光信号阳性，非致病性钩体及其他非钩体菌均无扩增。对于倍比稀释的质粒标准品，Real-timePCR和普通PCR的最低检测下限分别是10copy／μl和10。copy／μl。对于倍比稀释的钩体染色体DNA，两者的最低检测下限分别为：100fg／μl和1ng／μl。25份现场鼠肾标本检测显示，两种方法的检测结果一致。结论以rrs为靶基因建立的Real-timePCR技术，具有较高的灵敏度和特异度，可用于致病性钩体的病原学检测。

多位点可变数目串联重复序列分析对致病性钩端螺旋体分型的研究

钩端螺旋体（钩体）病是一种自然疫源性疾病。近年来以可变数目串联重复序列（variable number of tand emrepeats，VYTR）为基础的分型方法，逐渐被应用于分子流行病学研究中。本研究选取我同致病性钩端螺旋体15群15型参考菌株，初步探讨多位点可变数目串联重复序列分析（MLVA）在钩体病分子流行病学研究中的应用价值。

多位点串联重复序列分析在钩端螺旋体基因分型和流行病学中的应用

由于许多致病性细菌在遗传学上非常相似，使得细菌间的鉴别非常困难。近年来，随着越来越多的细菌全基因组序列分析和测定，DNA串联重复序列逐渐吸引了人们关注的目光。

2011年贵州省钩端螺旋体病疫区鼠类动物带菌监测与菌株分型

由致病性钩端螺旋体（简称钩体）感染引起的钩体病是全世界流行的人兽共患传染病。由于钩体病通过疫水迅速传播，因而是洪涝、地震等自然灾害发生时重点检测的传染病。中国自然灾害频发，且不少地区是钩体病流行疫区。中国疾病预防控制信息系统数据显示，贵州省近年来钩体病发病率虽然有所下降，但病死率却呈上升趋势。

贵州省不明原因发热病例钩端螺旋体病原体分离鉴定研究

目的对贵州省钩端螺旋体(钩体)病疫区不明原因发热病例进行钩体分离鉴定和分子分型,了解其病原学特征,为当地钩体病的防治提供病原学依据。方法采集贵州省钩体病疫区黔东南州黎平县不明原因发热病例血液和尿液标本进行钩体分离培养,对分离的钩体疑似菌株通过致病性钩体G1/G2-PCR方法进行初步鉴定,进一步采用钩体血清群特异PCR进行分群鉴定,然后采用多位点序列分型(MLST)技术对其进行分子分型,并与国内常见血清群参考菌株进行聚类分析。结果从35例发热病例血液中分离得到3株钩体疑似菌株,分离率为8.6%,分别命名为17BX002、17BX003和17AJX008;3株菌株经钩体特异性G1/G2-PCR鉴定为致病性钩体;钩体血清群PCR鉴定显示,17BX002株为流感伤寒群钩体,其余2株菌为阴性(排除其为黄疸出血群、赛罗群、犬型、秋季群、流感伤寒群和七日热群);进一步的MLST显示,17BX002株为ST106型,与流感伤寒群聚类最近,而其余2株为ST96型,与巴达维亚群菌株一致。结论高发季节贵州省疫区不明原因发热病例中存在钩体感染病例,流感伤寒群和巴达维亚群为贵州省新发现钩体菌群。