MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用

目的:驯化MDCK细胞使之适应悬浮培养,以之作为生产流感病毒疫苗的介质,为以细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法:通过直接法和间接法分别驯化MDCK细胞,放大培养能悬浮生长的MDCK细胞,并以之作为介质培养流感病毒。结果:获得了能悬浮培养的MDCK细胞,其在悬浮条件下生长良好;以之作为载体培养流感病毒,可获得较高产量的病毒。结论:建立了悬浮培养的MDCK细胞,以之作为载体培养流感病毒可获得较高病毒滴度,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。

MDCK单克隆细胞库的建立及检定

目的:建立甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应MDCK单克隆细胞库,用于培养生产流感病毒疫苗,为细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法:用有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化,通过血凝和TCID50筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株,扩大培养建立细胞库并进行检定。结果:共制备了97株单克隆化MDCK细胞,筛选到甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞株,扩大培养建立了细胞库,经检定符合《中华人民共和国药典.三部》(2010版)对细胞库的要求。结论:建立了甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK单克隆细胞库,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。

无针青霉素皮试法取代传统有针皮试的实验研究

目的:开展无针青霉素皮试法与传统皮试方法的比较研究,为无针青霉素皮试法提供实验依据。方法:建立青霉素致敏豚鼠模型,并以无针和有针皮试法检测致敏豚鼠及对照豚鼠,比较其阳性检出率、假阳性率、漏检率和皮肤病理损伤评价等临床指标。结果:无针及有针皮试法对豚鼠致敏模型的阳性检出率均为100%,无假阳性及漏检;且相较于传统有针皮试,无针皮试阳性结果更明显,造成的皮肤病理损伤更小。结论:无针青霉素皮试对过敏豚鼠检出精确,皮试阳性结果相比于传统有针注射更明显,并且无恐针情绪,造成法人皮肤病理损伤也更小,有望在临床上取代针头青霉素皮试法。

金属Ni诱导非晶硅薄膜晶化研究

采用金属镍诱导晶化非晶硅薄膜的方法制备多晶硅薄膜,研究了不同退火温度和退火时间对晶化效果的影响,使用SEM、EDS和XRD分析了薄膜的晶化效果。实验发现,非晶硅薄膜在460℃以下退火不能晶化,在460℃退火30min已全部晶化;随着退火温度升高或退火时间延长,晶化效果变好;退火2h之后晶体生长近乎饱和。

布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察

目的比较布鲁杆菌6种抗原表位所获得的基因工程疫苗的免疫保护效率。方法布鲁杆菌核糖体蛋白L7/L12、胞质蛋白P39、细胞表面蛋白BCSP31、二氧四氢喋啶合成酶BLS、16.5×103的外膜蛋白PAL和翻译起始因子IF3的基因片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建的核酸疫苗及上述6条片段转入pET32a(+)后诱导表达的的重组蛋白免疫小鼠,3次免疫后进行攻毒实验,对其免疫保护效率进行初步观察。结果L7/L12和BLS的重组蛋白疫苗和核酸疫苗都产生了非常显著的保护作用,P39的核酸疫苗、IF3和BCSP31的重组蛋白疫苗也产生了非常显著的保护作用,其中L7/L12核酸疫苗的保护效率最高。结论初步认为布鲁杆菌的优势抗原表位所获得的基因工程疫苗可产生一定的抗布鲁杆菌作用,可作为未来布鲁杆菌新型疫苗的候选者,有进一步研究的价值。

甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应性MDCK细胞的筛选及鉴定

目的筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株高适应的MDCK单克隆细胞株,用于培养生产流感病毒疫苗,为细胞代替鸡胚生产制备流感病毒疫苗提供保证。方法通过有限稀释法将MDCK细胞进行单克隆化,扩大培养建立单克隆化细胞库,通过血凝和TCID50筛选甲型H1N1流感病毒疫苗株的高适应性单克隆化细胞株,并鉴定所获得的细胞株细胞表面NeuAcα2,6 Gal的丰度。结果共制备了97株单克隆化MDCK细胞,经过甲型H1N1流感病毒疫苗株的筛选,共筛选到2株高适应甲型H1N1流感病毒疫苗株的MDCK单克隆化细胞株,其TCID50分别为6.68 log10 TCID50/ml和6.77 log10 TCID50/ml,其表面NeuAcα2,6 Gal的丰度明显提高。结论成功培养了MDCK单克隆细胞株,经筛选获得的单克隆细胞株其血凝滴度,TCID50都比普通MDCK细胞有明显提高,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。

中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用

目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。

炭疽杆菌培养上清液抗原的制备及免疫保护效果测定

目的制备炭疽培养上清液抗原并对其免疫效果进行测定。方法将炭疽A16r菌种接种于培养基中培养,收集无菌滤液,并进行超滤浓缩,经Al(OH)3佐剂吸附后,皮下免疫Balb/c小鼠,用炭疽Vollum(s)强毒株腹腔攻击测定其免疫效力。结果制备出具有高保护性的上清液抗原,9 h产物对Balb/c小鼠免疫效果良好(94.4%)。结论本研究为进一步研究炭疽疫苗免疫保护机制和炭疽疫苗改进研究打下基础。

玉符河流域分布式洪水预报模型及应用

玉符河是济南西南部防洪安全的主要威胁,高精度洪水预报是科学调度防洪工程、降低防洪风险的基础。在分析暴雨洪水特征的基础上,识别了流域主要产汇流机制,结合地形、土壤、植被、水库/塘坝分布等下垫面信息,建立了玉符河流域分布式洪水预报模型;选用卧虎山水库2010-2013年4场典型洪水过程率定了模型参数,检验了模型精度;选择典型洪水过程,通过连续模拟结合滚动修正,预估了暴雨过程的流域初始条件,应用区域降水预报数据驱动模型预报流域洪水过程,结果表明模型在72 h预见期内具有较高精度,能够为水库防洪调度提供支撑。

高致病性人禽流感H5N1疫苗滴鼻免疫应答效果的初步研究

目的通过高致病性人禽流感H5N1全病毒-MF59佐剂疫苗滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价该疫苗所诱导的系统免疫与黏膜免疫应答效果。方法以不同剂量抗原按比例与MF59佐剂配伍制成粘膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠,二免2周采血检测血清IgG、IgM效价及血清中HAI(HAinhibitor)的中和抗体效价,同时收集鼻、肺灌洗液,检测其IgG和sIgA抗体效价。结果H5N1+MF59组血清抗体效价较H5N1组有显著升高(P<0.01);在各剂量组中,随着剂量的增加抗体效价呈上升趋势,12μg后抗体效价呈下降趋势,以H5N1+MF59(12μg)组效价最高;肺鼻灌洗液中,均可检测到特异性分泌型IgA、IgG,其中特异性分泌型IgA效价略高于IgG;抗体亚型的分布以IgG1、IgG2b为主。结论灭活高致病性禽流感全病毒H5N1在佐剂MF59作用下可诱导机体产生体液免疫应答,同时还可以在黏膜局部产生特异性分泌型IgA、IgG,为高致病人禽流感病毒H5N1黏膜疫苗的研制奠定了基础。

SARS-CoV抗原的纯化与鉴定

目的纯化灭活SARS-CoV为研制马抗SARS-CoV免疫球蛋白提供抗原.方法将灭活的SARS-CoV悬液超滤浓缩,用Sepharose 4 Fast Flow分子筛和阴离子交换柱层析纯化,用高效液相色谱、SDS-PAGE和电镜观察测定抗原的纯度.结果将01、02和03三批SARS-CoV悬液分别进行11.2倍、12.5倍和25.0倍超滤浓缩,抗原的回收率依次为48.6%、46.3%和55.6%,凝胶过滤层析后抗原的回收率依次为81.6%、79.3%和86.0%.再经阴离子交换梯度层析进一步提高了抗原的纯度和浓度,蛋白的比活性由纯化前的0.11U/μg增加到1.44U/μg.电镜下观察到SARS-CoV抗原颗粒完整,呈圆形或椭圆形状,直径在80～120 nm之间.SDS-PAGE显示主要条带位于Mr43 000～66000之间,经质谱扫描分析确定该成分为Mr46 000.高效液相层析法分析抗原纯度为97.0%.马抗SARS-CoV免疫球蛋白中和抗体效价在1:6 400～1:12 800之间.结论本研究为制备高效价的马抗SARS-CoV免疫球蛋白奠定了基础.

马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01株中和作用的研究

观察马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01毒株的中和作用,为马抗SARS-CoV免疫球蛋白用于SARS的治疗提供科学的依据。采用CPE、MTT测定马抗SARS-CoV免疫球蛋白对SARS-CoV GZ-01株的中和作用。结果显示,马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab’)2治疗性抗体对SARS-CoV GZ-01株具有很好的中和作用,三批马抗SARS-CoV免疫球蛋白的CPE和MTT中和效价分别达到1:6400、1:6400、1:12800,且两种方法测得结果一致。

抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)_2治疗性抗体对SARS-CoVBJ-01株的中和作用

目的观察马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2治疗性抗体对SARS-CoVBJ-01毒株的中和作用。方法采用细胞病变法(cytopathiceffect,CPE)、四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazoliumassay,MTT)测定马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2对SARS-CoVBJ-01株的中和作用。结果三批马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2对SARS-CoVBJ-01株有很好的中和作用,CPE和MTT法测得中和效价分别为1∶6400、1∶6400、1∶12800。结论研制的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2对SARS-CoVBJ-01株有很好的中和作用,并且两种方法结果一致,为SARS的治疗提供了可靠的依据。

炭疽AVA疫苗特异性抗体分泌细胞检测方法的建立

目的 应用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术,建立一种检测炭疽AVA免疫后特异性抗体分泌细胞的方法,用于检测和评价炭疽无菌培养滤液抗原特异性抗体形成细胞的功能.方法 无菌分离小鼠脾细胞,建立一系列特异性ELISPOT检测炭疽无菌培养滤液抗原特异性抗体分泌细胞的参数：包括抗原最佳包被浓度、细胞最适孵育时间、反应体系中细胞浓度以及亲和素抗体工作浓度的确定,同时检测上清中抗体效价,并以不相关抗原包被,检验方法的敏感性和特异性.结果 当抗原包被浓度为7.5μg/mL时,不同细胞浓度反应曲线最稳定 细胞数为5×10^6/mL时,不同包被浓度形成的斑点数适量,易于计数 且在抗体稀释度相同情况下,脾细胞孵育时间为3～6 h所获得的斑点数最清晰,背景着色最浅,容易被仪器识别 同时,特异性抗原包被组所获得的斑点频数高于无关抗原包被组（P＜0.01） 反应体系上清中未检测到抗原特异性抗体.结论 该方法敏感、特异,可用于AVA抗原免疫后体液免疫评价.

抗SARS-CoV血清抗体体外抗SARS病毒实验研究

目的研究三个批号的抗SARS-Cov血清抗体体外对SARS-CoV的抑制作用。方法采用MTT法,观察药物对SARS-Cov的抑制作用。结果MTT法测得三个批号的抗SARS-CoV血清抗体的最大无毒浓度均小于10μg/mL。不同时间点的治疗指数(TI)2h组>6h组>12h组>24h组;不同批号的治疗指数(TI)200307批>200306批>200308批。结论在本实验条件下抗SARS-CoV血清抗体体外有一定的抗SARS-CoV作用,为其治疗SARS-CoV感染提供了实验依据。

无针皮内注射免疫甲型H7N9流感裂解疫苗的免疫效果评价

目的开展无针皮内注射免疫甲型H7N9裂解流感疫苗的安全性及有效性评价,为无针注射免疫疫苗提供实验依据。方法采用无针皮内注射H7N9裂解流感疫苗免疫小鼠和大鼠,并用有针肌肉注射免疫做对照,通过活体成像技术观察疫苗的分布情况,并采用血疑抑制试验测定疫苗免疫后的血清中和抗体效价、滴鼻攻毒评价免疫保护及DRAIZE评分与病理检测注射损伤情况。结果无针皮内注射免疫疫苗在真皮内呈池状分布,且疫苗驻留时间明显长于在肌肉层的驻留时间。无针皮内免疫3μg抗原的甲型H7N9流感裂解疫苗可起到肌肉免疫15μg抗原的同样血清学保护水平及免疫保护效果。结论无针皮内注射免疫甲型H7N9裂解流感疫苗安全、有效,且抗原用量是有针肌肉注射免疫抗原用量的1/5量,将为流感疫苗免疫防控提供新的技术策略。

对WTO条件下商誉会计问题的探讨

本文对WTO条件下商誉的重要性以及商誉会计的 5种有代表性的观点进行了评述 ,认为合并商誉应当比FASB阐述的组成 3的范围要窄一些 ,只包括收购企业支付了代价的部分 ,未支付代价的部分不包括在购买价差中 ,也不应作为合并商誉的组成部分。商誉的计算公式为 :“商誉 =持续经营商誉 +支付成本的合并商誉”。

CIP29对布鲁氏菌侵袭和巨噬细胞凋亡影响的初步研究

目的研究CIP29在细胞中的定位及其对巨噬细胞凋亡和布鲁氏菌侵袭的影响。方法通过RT-PCR方法从细胞中获取CIP29基因片段,并将其亚克隆入质粒载体pET28a和eGFP,构建原核表达质粒pET28a-CIP29和真核表达质粒eGFP-CIP29,原核表达质粒用于制备CIP29抗体,用于后续CIP29蛋白的检测;真核表达质粒用于转染巨噬细胞,通过荧光显微镜、Western blot技术检测CIP29在真核细胞中的表达及定位,Annexin-Ⅴ/PI双染检测其对细胞凋亡的影响,布鲁氏菌侵袭试验检测其对布鲁氏菌入侵巨噬细胞的影响。结果获得了CIP29基因,构建的表达质粒pET28a-CIP29和eGFP-CIP29经测序和双酶切鉴定,证实重组表达质粒构建成功。将pET28a-CIP29转化BL21中,CIP29蛋白得到了表达,制备了特异性抗体,经ELISA检测效价达1∶25600。进一步构建真核表达质粒eGFP-CIP29,转染细胞后,荧光显微镜观察结果显示其定位于核内,但也有部分扩散之胞质中,CIP29可诱导细胞的凋亡,但对布鲁氏菌侵袭的影响无统计学意义。结论本研究获得CIP29重组蛋白,并制备了其多克隆抗体,CIP29瞬时高表达诱导巨噬细胞凋亡。

流感病毒灭活疫苗可溶性微针制备及评价

目的初步研究负载流感全病毒灭活疫苗可溶性微针体外评价方法和经皮免疫效果。方法将流感全病毒灭活疫苗溶液与微针基质材料混匀干燥后复溶,体外血凝试验检测疫苗血凝素活性,透射电镜和动态光散射分析疫苗微针复溶后流感全病毒疫苗变化情况;选择筛选的材料羧甲基纤维素和硫酸软骨素作为主要基质与疫苗混匀制备微针溶液,滴加到微针制作模具上,抽真空使疫苗基质溶液填充针体,室温干燥、脱模,贴于猪皮肤检测微针硬度,将Cy7标记流感疫苗可溶性微针贴于小鼠腹部后活体成像检测流感疫苗皮内存留时间,动物免疫试验第2次免疫后14 d检测血抑效价。结果通过血凝试验筛选出硫酸软骨素和羧甲基纤维素为主要基质,贴片疫苗血凝活性为96%和86%,显著高于其它3种材料贴片疫苗活性;透射电镜显示PBS对照组中流感灭活病毒颗粒多呈单个散在分布,罕见聚团,2种贴片复溶后流感灭活病毒多呈聚团,罕见单个病毒颗粒;动态光散射分析显示疫苗贴片复溶后病毒颗粒粒径明显增大,高于对照组中病毒粒径;皮肤组织病理显示2种疫苗微针均可刺穿猪皮肤;活体成像显示疫苗微针刺穿小鼠皮肤并溶解于皮内,疫苗存留时间较肌肉长;Balb/c小鼠免疫后分离血清,血凝抑制试验显示2种微针均产生血抑效价且硫酸软骨素微针血抑效价高于羧甲基纤维素微针。结论可溶性疫苗微针可刺穿皮肤溶于皮内产生免疫应答,为微针疫苗的研究提供了思路。