尖吻蝮蛇类凝血酶基因的克隆及生物信息学分析

为了获得蛇毒类凝血酶基因,本研究根据不同蛇毒类凝血酶cDNA5'和3'保守性序列设计了引物;通过RT-PCR从尖吻蝮蛇毒腺总RNA中扩增到1个808bp特异性片段,将该cDNA重组到pMD18-T载体中,利用生物信息学的方法对测序结果进行了分析。结果表明:该特异性片段中有一个783bp的开放阅读框架,其编码蛋白质序列与蛇的类凝血酶序列有98.5%的同源性,也具有蛇毒类凝血酶的典型特征。结论:本实验获得了一个新的尖吻蝮蛇类凝血酶基因。

兔防御素cDNA表达质粒的构建及其表达

将兔防御素 ( MCP-1 ) c DNA插入真核表达载体 pc DNA3的 Eco R 和 Xba 酶切位点之间 ,构建了兔MCP-1 c DNA的真核表达质粒 pc DEF。通过脂质体转染 ,使兔 MCP-1 c DNA在 COS-7细胞中表达 ,在转染60、84、1 0 8h后 ,提取总 RNA。采用 RT-PCR,在 2 88bp的位置扩增出 1条特异性带 ;RNA斑点印迹杂交表明 ,兔 MCP-1 c DNA在 60、84、1 0 8h均有表达。

差序氛围对知识型矿工不安全行为的影响——正念与心理契约违背的作用

为提升智慧矿山背景下煤炭企业的安全绩效,明确差序氛围对知识型矿工不安全行为的影响机制,基于资源保存理论和认知失调理论构建概念模型,以国内某智能化示范煤矿799名矿工作为研究对象,利用结构方程模型对假设进行实证检验。研究结果表明:差序氛围、心理契约违背对知识型矿工的不安全行为存在正向影响;正念对知识型矿工的不安全行为存在负向影响;正念-心理契约违背在差序氛围与知识型矿工不安全行为间起到链式中介作用。研究结果可为有效减少智慧矿山不安全行为的发生,保障煤矿企业的安全生产提供理论支撑。

^(60)Coγ-射线对冻干血浆中病毒灭活效果的研究

为提高冻干血浆临床应用的安全性,采用细胞感染法对人工污染病毒的新鲜冰冻血浆经60Co辐照灭活处理的效果进行了检测,同时用凝胶电泳和凝血因子分析仪检测60Co照射对冰冻血浆生物活性物质的影响。结果,60Coγ-射线经30 kGy的辐照剂量能完全灭活冻干血浆中的指示病毒;照射后的血浆白蛋白等成分含量略有下降,凝血因子活性减少了30%~40%。结论,60Coγ-射线辐照能有效灭活冻干血浆中的有包膜病毒和无包膜病毒,但对血浆蛋白活性有一定影响。

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的 2 0株鸡致病性大肠杆菌进行了药敏实验 ,筛选出 1 3株耐氧氟沙星 ( OFL )的菌株。经质粒提取、电泳和转化实验 ,获得一株由质粒介导的耐 OFL的多重耐药菌株。该菌株对参试的 1 1种抗生素全部耐药 ,其中 OFL MIC>50 μg/ml。该菌 R质粒电泳可见 6条带 ,转化大肠杆菌 DH5α,在 2 0 μg/ml OFL的 LB平板筛选得到转化子。该转化子含有原菌株中 2 .7kb的质粒 ,获得原菌株部分耐药性。连续转化 5次 ,均获得耐 OFL的转化子。证实该菌株对

凋亡蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

在获得凋亡蛋白融合基因重组质粒pMD18_T_EGF_PⅡ_Apoptin的基础上 ,成功地构建了重组表达质粒pET_2 8a_EGF_PⅡ_Apoptin ,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL2 1(DE3)感受态细胞中 ,经IPTG诱导表达 ,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS_PAGE)检测 ,结果表明 ,表达蛋白带位于 33kD处 ,凋亡蛋白融合基因获得高效表达 ,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的 4 0 %。表达蛋白经透析袋电洗脱法纯化后 ,对獭兔进行常规免疫 ,应用ELISA检测到较高的多克隆抗体效价 ,表明此蛋白具有良好的抗原性。Westernblot结果显示 ,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合。

亚甲蓝/光化学法对血浆中IgG的影响

目的 探讨亚甲蓝 /光化学法对血浆中IgG的影响 ,评价含SARS抗体的病毒灭活血浆临床应用的可行性。方法 将不同浓度的亚甲蓝分别加入人血浆中 ,经JY I型血浆病毒灭活仪处理后 ,用Native PAGE和SDS PAGE测定IgG含量、亚基数目和分子量 ,用Western blot检测其抗原性。 结果 经亚甲蓝 /光化学法处理后血浆的IgG含量、亚基数目、分子量和抗原性均未见变化。 结论 亚甲蓝 /光化学法对血浆中IgG的影响较小 。

钴^(60)-γ射线辐照法消毒冻干免疫球蛋白的效果观察

目的探讨钴60-γ射线辐照消毒法处理冻干免疫球蛋白的可行性。方法采用病毒定量检测方法,观察钴60-γ射线辐照法对免疫球蛋白中病毒灭活效果。结果含病毒的免疫球蛋白经30kGy剂量钴60辐照处理,对含不同蛋白保护剂的冻干IgG制品中辛德比斯病毒灭活对数值≥5.5TCID50。经30kGy剂量辐照灭菌处理,冻干IgG制品外观未见明显改变,各处理组之间的pH值与未处理组结果相近。蛋白电泳Native-PAGE分析各保护剂组之间无明显差别,保护剂浓度高低对试验结果无明显影响;SDS-PAGE分析,各处理组中的IgG经还原后其重链和轻链仍清晰可见,各保护剂组结果间无明显差别。高效液相色谱法检测结果显示,三种保护剂对IgG分子的保护效果较好,分子聚合和断裂峰明显减少。冻干IgG经辐照处理后抗原含量与对照相比均达80%以上,各保护剂组之间抗原含量基本一致。结论冻干血浆蛋白制品IgG经γ-射线照射后能够保持一定的结构和功能的完整性。

竞争性RT-PCR检测铜对Ctr1 mRNA表达的影响

为了应用竞争 RT- PCR法检测铜对猪传代肾细胞 (PK15 )中特异性铜转运蛋白 Ctr1基因 m RNA表达水平的影响 ,经 2次克隆 ,将筛选出一段 4 0 0 bp的核苷酸序列 ,插入 RT- PCR扩增出的 5 30 bp Ctr1目的片段中 ,构建了插入突变型 Ctr1- c DNA竞争模板。再将竞争模板与各试验组 c DNA同时进行 PCR扩增。结果 ,猪肾 PK15细胞 Ctr1基因m RNA表达量在 7.8～ 31.2 μmol/ L Cu范围内随铜添加浓度的升高减少 ,当铜添加浓度达到 6 2 .5 μmol/ L 时 ,其表达量又有所回升 ,呈双相反应。

长链PCR技术评价^(60)Co-γ射线灭活病毒的研究

目的探讨用长链PCR技术评价60Co-γ射线辐照灭活伪狂犬病毒(pseudorabies virusPRV),后残余病毒感染性的可行性。方法针对PRV糖蛋白gD基因前后的保守区设计预计产物长短不一的5对引物,用PCR扩增经不同剂量60Co-γ射线照射后的PRV核酸,并同时以细胞感染法做平行对照。结果60Co-γ射线辐射对PRV核酸的破坏有剂量依赖性,随着60Co-γ射线剂量的增加,PRV核酸被破坏程度增加,剂量≥20kGy时完全被灭活。5条不同长度PCR扩增产物中,只有长片段3.9kb的检出与细胞培养结果一致。结论γ射线对PRV核酸的损伤程度随γ射线剂量增加而增大;用长链PCR(3.9kb)来评价经60Co-γ射线辐照灭活病毒后残余病毒的感染性是可行的。

FFP经亚甲蓝光化学法灭活病毒并直接冻干于血袋的冻干血浆研制

目的探索制备冻干血浆的新工艺,研制适合在艰苦环境下储运和方便使用的新型冻干血浆。方法采用亚甲蓝光化学技术对新鲜冰冻血浆(FFP)做病毒灭活处理,再将FFP直接冻干于血袋中,观察不同条件下的保存效果。结果亚甲蓝光化学技术(终浓度为1μmol/L)能有效灭活血浆中的Sindbis病毒、PRV和VSV等指示病毒,处理30min后灭活效果>4.75LgTCID50,经细胞3代盲传证明灭活病毒效果可靠。新型冻干血浆外观成淡黄色疏松体,残水量为2.2%—2.5%,室温下<2min完全溶解;储存稳定性试验表明,新型冻干血浆中的FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅨ和FⅪ在25℃和4℃比较稳定,高温(40℃)保存对其活性有一定影响。结论采用亚甲蓝光化学灭活病毒技术和袋装血浆冻干技术制备新型冻干血浆是可行的。

蛇毒金属蛋白酶及去整合素的结构与功能

蛇毒金属蛋白酶是蛇毒主要功能性蛋白质之一,它直接作用于局部组织的毛细血管,影响毛细血管内皮细胞与基底膜之间的相互作用;蛇毒去整合素与蛇毒金属蛋白酶来自共同的前金属蛋白酶原,这些酶原都含有4个共同的结构域:信号肽、前导肽、蛋白酶结构域、间隔区。去整合素因能特异性识别整合素而得名,蛇毒去整合素为低分子量蛋白质,含有多个Cys残基,它能阻断整合素与其配体的结合,抑制整合素介导的细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的黏附反应,在血小板聚集、感染、炎症反应、肿瘤转移等病理过程中发挥重要作用。

^(60)Coγ-射线辐照灭活冻干血浆中病毒的研究

冷冻干燥血浆做为一种常用的血液制品,由于病毒安全性的问题没有完全解决已停用多年。冻干血浆具有可在常温下保存,且保存时间长,重量轻,易于运输,适合于大批量生产等优点。随着临床方面的需要,尤其是非常适合战时的需要。国内已有多家科研单位和血液制品生产厂商在开展冻干血浆病毒灭活的研究工作。大家所选用的方法多为有机溶剂/表面活性剂(S/D)方法、干热方法(如72℃、80℃干烤)和100℃煮沸30min等。本文按《病毒灭活规程》的要求,探索用60Coγ-射线不同剂量辐照冻干血浆,观察对所加入的几种指示病毒的灭活效果。

人巨细胞病毒编码US28分子可促进CREB相关转录活性

目的:构建人巨细胞病毒(HCMV)编码的趋化因子受体类似物US28基因真核表达载体并观察其对通用转录因子磷酸化的环单磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)的表达量和相关转录活性的影响。方法:从病毒原液中扩增人巨细胞病毒编码US28基因,构建含US28基因真核表达载体,将该载体与CREB转录活性报告基因和恒定表达的内对照质粒组成的双萤光素酶报告基因系统共转染至HEK293细胞中,Western blot法检测CREB活性形式p-CREB的表达量,并分析US28促使的CREB相关的相对转录活性变化。结果:经PCR鉴定及测序结果证实,所构建的重组载体正确。US28可有效促进p-CREB的表达量与其提升转录的功能活性,揭示了US28与CREB相关转录活性增强的密不可分的关系。结论:人巨细胞病毒可利用宿主通用转录因子CREB增强相关基因转录,从而有可能促进病毒的活化进程。

常规保存条件下血小板中污染细菌生长动力学研究

为探讨细菌和真菌在常规保存条件下的浓缩血小板中生长繁殖状况,为血小板细菌污染检测与灭活方法提供依据,在实验室采取血小板中人工污染菌和活菌计数方法进行了试验观察。结果,污染后血小板在常规保存条件下(22±2)℃,最长保存期7d内每日含菌量变化,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均在第2、3d表现出迅猛的增殖高峰,第4d以后增殖趋于平缓。白色念珠菌增殖速度较为平缓,但亦呈持续增殖趋势。结论,细菌与真菌均可在常规保存条件下的血小板中持续生长,保存时间越长,发生输血后并发症的可能性越大。

兔防御素(MCP-1)cDNA的克隆与序列分析

从兔脾脏细胞中分离提取总RNA ,经反转录PCP(RT -PCR)扩增出兔巨嗜细胞阳离子多肽 (MCP- 1)cDNA ,插入经EcoRI和XbaI双酶切的pUC19中 ,构建了克隆质粒pUCDEF .进行了限制性酶切鉴定和序列分析 ,结果在扩增出的cDNA 2 88个碱基中 ,在前片段中有一个碱基与发表的兔MCP - 1cDNA序列不同 ,即第 157位碱基由G变为A ,导致编码的氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。该cDNA全长 2 88bp ,编码 94个氨基酸 ,由编码信号肽 。

应用TaqMan荧光定量PCR技术建立HIV前病毒检测方法

目的建立HIV前病毒荧光定量PCR检测方法。方法常规培养8E5/LAV细胞,收集后计数,提取HIV前病毒核酸,运用实时荧光定量PCR法扩增晚期逆转录基因片段(HIVFL)。结果建立的实时荧光定量PCR技术检测灵敏度可达1拷贝,扩增结果稳定可靠。结论成功建立了HIV前病毒检测方法,为今后筛选和鉴定潜伏感染细胞以及评价抗-HIV药物的治疗效果奠定基础。

鸡致病性大肠埃希氏菌耐氧氟沙星质粒的检测

对分离的 2 0株鸡源致病性大肠埃希氏菌进行药敏试验 ,筛选出 13株耐氧氟沙星 (OFL)的菌株 ,进行质粒提取、电泳和转化试验 ,获得 1株由质粒介导的耐OFL多重耐药菌株。该菌株对参试的 11种抗生素全部耐药 ,其中OFLMIC高于 5 0 μg/mL。该菌R质粒电泳可见 6条带 ,转化大肠埃希氏菌DH5α在含 2 0 μg/mLOFL的LB平板筛选得到转化子。该转化子含有原菌株中 2 .7× 10 3 b的质粒 ,获得原菌株部分耐药性。连续转化 5次 ,均获得耐OFL的转化子 。

华北地区榛树主要病虫害防治技术

华北地区榛树的主要病虫害是榛实象鼻虫、介壳虫、木蠹蛾、金龟子、白粉病等,分别进行了介绍,并提出了相应的防治技术。