杧果MiOFP1基因的表达与功能分析

【目的】卵形家族蛋白(ovate family proteins,OFPs)在植物生长发育及逆境响应过程中扮演重要角色。前期通过杧果成花基因酵母文库筛选,获得了一个MiOFP1基因,为明确其功能,对MiOFP1的表达模式和转基因功能开展了研究。【方法】在本研究中分析了杧果MiOFP1的启动子序列;通过实时荧光定量PCR技术分析MiOFP1在杧果不同组织器官和不同生长发育期叶片中的表达模式;转化构建好的超量表达载体并侵染拟南芥研究MiOFP1的功能。【结果】四季蜜杧MiOFP1启动子包含激素响应元件:ABA响应元件、GA响应元件、SA响应元件和乙烯响应元件,逆境响应元件:盐响应元件、脱水响应元件、MYC转录因子和MYB转录因子结合位点。组织特异性表达分析显示,MiOFP1在各组织器官中均有表达,且在童期实生树和成年期嫁接树的茎中表达量最高,在成熟果实中表达量最低;嫁接树不同成花发育时期表达分析结果显示,MiOFP1在营养生长期的叶中表达量最高,在成花诱导期和花发育期表达水平较低。转基因功能研究显示,超量表达MiOFP1的拟南芥出现晚花表型,抽薹期叶片中成花抑制基因FLOWERING LOUS C(FLC)的表达水平显著上调,而成花促进基因FLOWERING LOCUS T(FT)的表达水平显著下调。逆境胁迫处理显示,ABA处理显著抑制拟南芥种子的萌发与根的伸长,但通过转基因显著提高了拟南芥种子的萌发率,降低了拟南芥根长对ABA的敏感性。进一步分析显示,MiOFP1显著提高了拟南芥在ABA处理后的脯氨酸含量和过氧化物酶活性,上调了ABA代谢相关基因的表达水平。【结论】明确了杧果MiOFP1抑制成花,且降低了转基因植株对ABA的敏感性,为进一步探索杧果MiOFP1参与杧果成花和逆境胁迫应答的分子机制奠定基础。

芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

【目的】锌指蛋白(zinc finger protein,ZFP)在植物非生物胁迫应答中起重要的作用,研究两个锌指蛋白基因MiZAT10A和MiZAT10B转入拟南芥对盐、干旱、重金属以及外源激素等非生物胁迫的应答,为抗逆育种提供理论依据。【方法】利用在线软件PLACE和MEME分别对芒果MiZAT10A和MiZAT10B进行启动子顺式作用元件以及motif预测和分析,并利用TBtools软件和‘四季蜜芒’基因注释文件(GFF文件,未公开)绘制染色体定位图;通过实时荧光定量分析MiZAT10A和MiZAT10B的组织表达模式;构建芒果MiZAT10A和MiZAT10B超量表达载体,采用农杆菌花序浸染法转化模式植物拟南芥,观察并记录转基因拟南芥开花表型以及在盐、干旱、重金属以及外源激素脱落酸和赤霉素处理下的根生长情况。【结果】启动子顺式元件分析显示,两个基因的启动子区域都有许多光响应元件、激素响应元件和非生物胁迫响应元件。表达模式分析显示,MiZAT10A与MiZAT10B在芽和花中表达水平最高。MiZAT10A和MiZAT10B分别获得了9株和14株转基因拟南芥,开花表型分析显示,MiZAT10A和MiZAT10B转基因拟南芥提早开花。在盐胁迫、干旱胁迫和重金属胁迫以及GA3和ABA激素处理下,两个超量表达转基因拟南芥的根长显著长于WT。【结论】超量表达的MiZAT10A与MiZAT10B可使转基因拟南芥提前开花并提高其对盐、干旱、重金属及外源激素GA3和ABA的抗性。

香水柠檬RHF2A的克隆与互作蛋白的筛选

【目的】以香水柠檬(Citrus limon (L.) Burm. F.)为研究对象,分析两个RHF2A的时空表达规律,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补试验(BiFC)筛选、验证其互作蛋白,为深入研究RHF2A在香水柠檬自交不亲和过程中的分子作用机制奠定基础。【方法】从前期转录组和泛素修饰组(未公开)筛选获得2个E3泛素连接酶RHF2A(RING-H2 Zinc Finger2A)基因RHF2A-1、RHF2A-2,并克隆其全长序列,通过生物信息学分析2个RHF2A的序列和蛋白质结构,预测其启动子顺式作用元件,构建35S-RHF2A-GFP融合蛋白表达载体用于亚细胞定位分析,采用实时荧光定量PCR分析两个RHF2A的时空表达模式,构建酵母双杂诱饵载体从香水柠檬酵母文库筛选互作蛋白。构建BiFC载体,在洋葱活体细胞内对目标蛋白进行互作验证。【结果】从香水柠檬克隆获得RHF2A-1、RHF2A-2,ORF全长分别为1 161和1 134 bp;NCBI结构域预测发现其具有Ring/U-box结构域。启动子分析发现其具有花粉特异性表达相关元件POLLEN1LELAT52、GTGANTG10。组织表达分析发现RHF2A-1在花粉特异性表达,RHF2A-2在叶中特异性表达;时空表达分析结果显示,RHF2A-1在自交柱头表达量从第1天开始升高,第3天达到峰值,是杂交柱头表达量的5倍以上。亚细胞定位显示RHF2A-1和RHF2A-2定位在细胞核。经过Uniprot网站预测其互作蛋白显示RHF2A能与KRP6、AT3G57370、UBA1、FBL17、SK11蛋白相互作用,推测其参与自交不亲和泛素化反应途径、配子体发育调控、花粉的生长发育等生物学过程。通过酵母双杂交技术筛选出72个克隆,对其测序并进行Blast比对后排除重复克隆,最终得到ABCF3等20个候选互作蛋白。经过一对一互作验证、双分子荧光互补实验确定RHF2A-1与ABCF3-2存在互作关系。【结论】RHF2A-1的时空表达规律与自交不亲和过程中花粉在雌蕊上的萌发规律相吻合;筛选得到柠檬授粉过程中直接影响花粉生长发育的互作候选蛋白,初步证明RHF2A-1在自交不亲和过程中具有重要作用。

ISSR分子标记在果蔬资源上的应用及研究进展

ISSR分子标记是为了克服SSR引物设计费时费力的问题,在此发展起来的一种分子标记。其操作简单、高效,试验成本低,且多态性高、重复性好、引物设计简单。本文对几种常用分子标记的优缺点进行简单比较,重点介绍了目前广泛应用于果蔬资源研究中的ISSR分子标记的原理和特点,对ISSR分子标记技术在果蔬资源的遗传多样性和遗传结构、种质资源鉴定以及遗传图谱等方面的研究进展及应用进行综述,旨为果蔬资源的进一步研究利用提供参考依据。

芒果MiAGL80基因特征及表达模式分析

AGL80/FEM111属于Type I型MADS-box基因家族,调控拟南芥中央细胞及胚乳的发育。目前,AGL80在木本植物中鲜有研究报道。本研究从芒果转录组数据中获得并命名为MiAGL80基因。生物信息学分析表明:MiAGL80基因位于1号染色体上,ORF全长为897 bp,无内含子,编码299个氨基酸,理论等电点为4.95,蛋白质分子量为73.19kDa,氨基酸序列中含有1个MADS_SRF_like保守结构域。系统进化树分析表明:芒果MiAGL80与阿月浑子PvAGL80最为接近,且同源性最高,氨基酸相似性为64.29%。启动子序列分析显示:芒果MiAGL80基因的启动子包含光响应元件、逆境响应元件、转录因子结合位点以及激素响应元件等,其中光响应元件相较其他元件数量较多,不仅包含光调节相关元件,还包含昼夜节律表达所必需的区域元件;激素响应元件中包括赤霉素响应元件、生长素响应元件和乙烯响应元件;逆境响应元件主要是干旱响应元件。基因表达模式分析显示:在芒果果实中,MiAGL80随着芒果果实的逐渐发育,其在果肉中的表达水平持续下降,在花后100 d的果实与成熟果中的表达水平很低;在种胚发育过程中其表达水平先上升后下降,在花后100 d的胚和成熟胚中表达水平也很低;在种胚萌发发育期,其表达水平再次升高。在成花发育不同时期的组织器官中:MiAGL80主要在叶片中表达,其表达量先降低后逐渐升高,然后再降低,在花器官发育末期达到最大值;在花芽中的表达水平也显著高于营养芽;但在茎中表达量极低,几乎不表达。说明MiAGL80在芒果果实发育、种胚发育、种子萌发以及成花调控方面发挥作用。以上研究结果为深入研究MiAGL80基因的功能提供参考。