tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究

【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆。【结果】带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192︰21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株。【结论】荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性。

严密型四环素调控系统调控的表达HCV-C基因双转基因小鼠模型的建立

目的制备严密型四环素调控系统调控下表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的双转基因小鼠,为进一步阐明核心蛋白Core与HCV感染所致的疾病以及与肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法严密型四环素调控部分(ApoE-rtTA-tTS)转基因阳性鼠和反应部分(TRE-HCV-C)转基因阳性鼠交配产生仔鼠,经PCR和Southern blot分析筛选出阳性鼠,免疫组织化学检测HCV-C蛋白双转基因小鼠肝组织内表达情况及其肝脏的病理变化。结果得到了2只携带有两种基因(tTS和HCV-C)的双转基因小鼠,成功制备了严密型四环素调控系统的HCV-C双转基因小鼠。结论结果表明,所建立的严密型四环素调控系统在动物模型中是可行的和有效的,它消除了普通四环素调控系统存在的本底泄漏表达的缺点,是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。

视网膜色素上皮细胞吞噬功能与MERTK-Ras-肌球蛋白通路关系的研究

目的：研究视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞吞噬功能与MERTK受体及其下游信号通路Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白的关系。方法：用视细胞外节膜盘（rod outer segments,ROS）于37益孵育离体培养的3~5代C57小鼠RPE细胞,在孵育0、30、60、120、180、240min终止吞噬反应。双重荧光标记法检测RPE细胞吞噬动力学;以MERTK及Ras抗体、磷酸化MEK及MLCK抗体应用Western-Blot方法检测不同孵育时间（30、60、120、180min）MERTK、Ras、MEK及MLCK的激活状态;以瞬时转染质粒方法抑制Ras及MERTK基因表达后,再次以Western-Blot方法检测对应时间MERTK-Ras通路激活状态及吞噬功能的变化。结果：C57小鼠RPE细胞吞入ROS发生在孵育30min,并在3h达到饱和。在吞噬过程中,随着孵育时间的延长,RPE细胞MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表达水平不断增多（与对照组相比,P〈0.05）。Ras及MERTK干扰后的RPE细胞与ROS共孵育（30、60、120、180min）的全过程中,MERTK、Ras、MEK和MLCK的蛋白表达及ROS的吞入数量始终维持较低水平,仅在孵育180min见到少量ROS吞入;与未转染RPE细胞相比,si Ras-RPE细胞及si MERTK-RPE细胞与ROS共孵育120、180min时,MERTK、Ras、MEK及MLCK的蛋白表达量均明显减少（P〈0.05）。结论：Ras-MEK-MLCK-肌球蛋白通路是鼠RPE细胞吞噬过程中MERTK受体激活的下游信号通路。

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1,为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠,以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠。方法重组构建含目的基因的质粒pApoE-rtTA-tTS,应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵,再植入代母输卵管,出生小鼠经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定。结果产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠。结论成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠,为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础。

tTS真核表达载体构建及稳定转染HepG2细胞系的建立

为了构建tTS真核表达载体,转染HepG2细胞,建立稳定转染的HepG2细胞系,采用PCR方法,以质粒pTet-tTS为模板扩增tTS基因的编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pApoE-rtTA-Neo,经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染HepG2细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的HepG2细胞系,用RT-PCR、Western blot法检年测tTS的表达,成功构建了pApoE-rtTA-tTS-Neo真核表达载体,并建立了稳定转染的HepG2细胞系,成功地表达目的基因。真核表达载体成功构建和稳定转染HepG2细胞系的建立为进一步研究tTS的功能奠定良好的实验基础。

黄斑裂孔指数与特发性黄斑裂孔手术视力预后的相关性分析

目的 评价黄斑裂孔指数（MHI）与特发性黄斑裂孔（IMH）视网膜内界膜剥离手术后视力预后的相关性.方法 30例接受玻璃体切割联合视网膜内界膜剥离手术治疗的IMH患者的30只眼纳入研究.患者均进行最佳矫正视力（BCVA）、裂隙灯显微镜、间接检眼镜及光相干断层扫描（OCT）检查确诊.OCT测量视网膜中心厚度,黄斑裂孔底径和高,计算黄斑裂孔高与底径比值,即MHI,并根据MHI大小将患者分为MHI≥0.5组和MHI＜0.5组.手术后随访3～24个月,平均随访时间10个月.将手术后BCVA与患者年龄、病程、MHI及手术前BCVA进行斯珀曼（Spearman）相关性分析,对MHI≥0.5组和MHI＜0.5组手术后BCVA差异进行独立样本设计定量资料t检验.结果 手术后30只眼黄斑裂孔闭合,闭合率为100%.患者手术后BCVA与MHI之间有相关性（r=0.852,P＜0.001）,与年龄、病程等变量无相关性（r年龄=0.001,P=0.804 r病程=-0.001,P=0.579）.MHI≥0.5组手术后视力好于MHI＜0.5组（t=5.552,P＜0.001）.结论 MHI与IMH患者视网膜内界膜剥离手术后视力存在相关性,可作为其手术后视力的预测指标之一.

神经干细胞

查阅了近年来关于神经干细胞的发育与分化的调控机制,对其研究成果作了简要全面的综述,为研究神经系统发育和中枢神经系统疾病的发病机制提供了实验室依据.

补阳还五汤治疗过敏性紫癜30例

目的：探讨中医益气活血法治疗过敏性紫癜.方法： 用补阳还五汤随证加减观察治疗过敏性紫癜30例.结果： 痊愈24例,显效6例,病程最短者1周,最长1个月.结论： 用益气活血法治疗过敏性紫癜有较好的疗效.