褪黑素对胆红素脑病大鼠脑顶叶皮质AQP4的调控及其保护机制研究

目的:研究脑顶叶皮质水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)在褪黑素(melatonin,MT)治疗胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE)中的表达变化,以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号通路在MT对AQP4调控中的作用,以探讨MT对BE的治疗机制。方法:80只出生5~7 d的健康SD乳鼠,根据其处理方式,随机分为以下5组:假手术组、BE模型组、MT干预组、PKC抑制剂(PKC inhibitor,PKCi)干预组和mTOR抑制剂(mTOR inhibitor,mTORi)干预组。采用HE染色和尼氏染色检测各组鼠脑皮质病理改变;采用干-湿重法测定各组脑顶叶皮质含水量;应用免疫荧光染色法检测脑皮质AQP4的表达区域;运用TUNEL染色法检测脑顶叶皮质神经细胞的凋亡变化;使用Western blot法测定各组鼠脑顶叶皮质AQP4、caspase-3、cleaved caspase-3和PKCε的表达量。结果:HE和尼氏染色显示,MT可减轻胆红素所致神经细胞的损伤。干-湿重法结果显示,MT可降低BE乳鼠脑顶叶皮质脑含水量。免疫荧光染色显示,BE组AQP4荧光强度增加,主要表达于大脑顶叶皮质血管壁和星形胶质细胞膜;MT干预可阻止BE所致AQP4表达的增加。TUNEL染色显示,MT可减少BE所致细胞凋亡。Western blot显示,与假手术组相比,BE组脑顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达增加,PKCε表达降低;MT干预可降低BE鼠顶叶皮质AQP4、cleaved caspase-3和caspase-3表达,增加PKCε表达。PKCi和mTORi均可下调PKCε的表达,阻止MT通过mTOR/PKC信号通路降低AQP4的表达。结论:MT可通过减少BE大鼠脑顶叶皮质中AQP4的表达来缓解脑水肿,并减少caspase-3介导的神经细胞凋亡。MT下调AQP4表达的机制与mTOR/PKC信号通路的激活有关。

胆红素对幼年大鼠海马细胞凋亡及水通道蛋白4表达的影响

目的:研究幼年胆红素脑病(BE)模型大鼠海马中水通道蛋白4(AQP4)的表达变化,并且探究其与海马细胞凋亡及认知功能障碍的关系。方法:采用7 d龄SD幼年大鼠经小脑延髓池注射未结合胆红素(UCB)建立BE模型,根据UCB作用时间的不同将其分为12 h、24 h、48 h、72 h和7 d组。采用HE和Nissl染色观察各组海马病理变化;应用TUNEL染色法检测海马细胞凋亡;应用Western Blot检测海马AQP4、LAMP1、caspase-3和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化;应用免疫荧光染色检测海马AQP4、LAMP1和GFAP的表达变化及AQP4^(+)/GFAP^(+)细胞数量的变化。结果:HE及Nissl染色显示,随着UCB作用时间的延长,海马神经细胞间隙不断变大,空泡逐渐增多,Nissl小体数量减少。TUNEL染色法显示海马凋亡细胞数量在UCB作用24 h组最多(P<0.05)。Western Blot结果显示,随着UCB作用时间的延长,海马细胞中caspase-3和LAMP1均上升至24 h达峰值(P<0.05)。免疫荧光结果显示,AQP4和GFAP均增加至48 h表达最高(P<0.05),AQP4^(+)/GFAP^(+)细胞数量在48 h组达最多(P<0.05)。结论:UCB的神经毒性作用可导致海马细胞凋亡增加至24 h达峰值,继发星型胶质细胞代偿性增生,并伴随AQP4的表达增加至48 h达峰值,以上变化可能与BE的认知功能障碍具有密切联系。