红松种子皮诺敛酸形成积累的多基因协同调控

为探讨红松种子皮诺敛酸生物合成的基因调控规律,以3个不同生长发育期(7月8日、8月10日、9月6日)的红松种子为材料,利用气相色谱飞行时间质谱法测定种子油脂脂肪酸组分及其相对百分含量,采用qRT-PCR方法分析脂肪酸代谢途径相关基因ACC、KAR、EAR、HAD、FATB、KASII、SAD、FAE1、KCR、FAD2、FAD8和⊿5D的表达差异,分析基因表达对皮诺敛酸形成积累的影响。红松种子油脂中共检测出10种脂肪酸,其中油酸、亚油酸和皮诺敛酸是主要脂肪酸。同时研究结果首次揭示了红松种子皮诺敛酸形成积累的多基因协同调控机制,对高皮诺敛酸油料植物的培育具有重要意义。

不同发育期红松种子含油率及种子油脂肪酸组成动态变化

以2016年不同发育期(7月8日、8月10日、9月6日、10月7日)的红松种子为原料,采用氯仿甲醇法测定种子含油率,GC-MS/MS测定种子油脂肪酸组成,分析不同发育期红松种子含油率及种子油脂肪酸组成的动态变化规律。结果表明:发育初期红松种子的含油率较低(4. 4%),随后迅速增加,并在9月6日达峰值(71%),之后降低;红松种子油中共检测出13种脂肪酸,其中油酸、亚油酸和皮诺敛酸为主要不饱和脂肪酸;红松种子不同发育期其油中油酸和亚油酸含量不断增加,但皮诺敛酸含量在8月10日达到峰值(16. 30%)后不断降低。研究可为红松种子采收期选择提供科学依据,对红松种子开发利用具有重要意义。

HPLC法测定重楼块根中4种重楼皂苷含量研究

建立HPLC测定重楼块根中4种重楼皂苷含量的方法。结果表明:重楼皂苷Ⅰ质量浓度在0.054~0.540 mg·m L^(-1)范围内线性关系良好,r=0.999 6(n=5),回收率为99.12%,RSD为1.95%;重楼皂苷Ⅱ质量浓度在0.043 4~0.434 mg·m L^(-1)范围内线性关系良好,r=0.990 8(n=5),回收率为99.10%,RSD为1.89%;重楼皂苷Ⅵ质量浓度在0.012 6~0.126 mg·m L^(-1)范围内线性关系良好,r=0.993 3(n=5),回收率为99.46%,RSD为2.01%;重楼皂苷Ⅶ质量浓度在0.010 3~0.103 mg·m L^(-1)范围内线性关系良好,r=0.999 1(n=5),回收率为96.52%,RSD为2.25%。HPLC法能够准确检测出重楼块根的主要皂苷成分及其含量,且操作简便,可为重楼中4种主要皂苷含量的检测提供科学方法。

沙棘果实不同器官脂肪酸差异的多基因协同调控

为探讨沙棘果肉高积累碳16脂肪酸和种子高积累碳十八不饱和脂肪酸的基因调控差异,以沙棘品系"TF-23"4个不同发育期(7月10日, 7月26日, 8月11日, 8月26日)的果肉和种子为研究材料,采用气相色谱飞行时间质谱法测定干果肉和种子油脂的脂肪酸组份及不同组份的相对百分含量,运用qRT-PCR分析脂肪酸形成相关基因KAR、FATB、Δ9D、KCS1、KASⅡ、SAD、FAD2、FAD3、FAD7和FAD8的表达模式,验证多基因表达对果实不同器官脂肪酸形成积累差异的影响。结果表明:(1)沙棘干果肉油和种子油中共检测出8种主要脂肪酸,果肉油脂中棕榈酸(35.15%)、棕榈油酸(26.21%)和异油酸(24.22%)为主要组份,种子油脂中异油酸(15.98%)、亚油酸(43.43%)和亚麻酸(26.70%)为主要组份。(2)沙棘果肉高积累棕榈酸、棕榈油酸和异油酸源于KAR、FATB、Δ9D和KCS1基因的高表达协同KASⅡ基因的低表达。(3)沙棘种子油脂高富集亚油酸、亚麻酸和异油酸源于种子发育过程中KCS1、KASⅡ、SAD、FAD2和FAD3基因的协同高表达。首次揭示出调控沙棘果肉和种子富集不同脂肪酸的关键基因是KASⅡ基因,种子中KASⅡ基因高表达为亚油酸和亚麻酸的富集提供了充足底物C18:0,果肉中KASⅡ基因低表达协同FATB和Δ9D基因高表达促进了棕榈酸和棕榈油酸的富集。这可为进一步遗传改良沙棘果肉和种子油脂肪酸组成提供科学参考,对沙棘开发利用具有重要意义。

四种木本油料内参基因筛选及Actin基因时空表达分析

以油茶、沙棘、文冠果和油用牡丹的成熟种子为材料,利用实时荧光定量PCR分析了7个内参候选基因GAPDH、Actin、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A在四种木本油料中的表达稳定性,并进一步验证了Actin基因在沙棘不同发育期种子和果肉中的表达。结果表明,6个内参候选基因GAPDH、TUB、eEF1α、RPL4、UBQ和e IF4A的表达水平在四种本油料种子间存在明显差异(p<0.05),内参候选Actin基因在四种木本油料种子中的表达较稳定(p>0.05)。Actin基因在沙棘种子和果实的不同发育期表达稳定(p=0.380和p=0.603),且在果肉和种子间在各个时期不存在明显差异(p>0.05)。这不仅可为沙棘果实不同器官基因表达差异研究提供内参基因,而且可为四种木本油料基因表达研究内参基因的选择提供科学参考。

沙棘非种子组织和种子油脂合成积累的源汇基因协同表达

为探讨沙棘非种子组织(果肉)和种子油脂合成积累与源汇基因表达间的关系,以2016年不同发育时期(7月10日,7月26日,8月11日,8月26日)的品系"TF-23"果实为材料,利用氯仿甲醇法测定果肉和种子含油量,采用q RT-PCR方法分析油脂合成源基因(GPD1)和汇基因(DGAT1,DGAT2)在果肉和种子间的表达差异及其对油脂合成积累的影响。结果表明:(1)沙棘果实发育过程中,果肉和种子含油率均呈逐渐上升趋势,但果肉的油脂合成积累速度快于种子,且果肉含油率20.62%明显高于种子6.16%。(2)源基因GPD1在果肉发育过程中一直维持在较高水平,明显促进了果肉TAG合成前体G3P的高效合成,而同期汇基因DGAT1和DGAT2的高表达则促进了TAG的高效积累;相反,种子发育过程中,源基因GPD1表达量非常低,而同期的DGAT1基因表达维持在较低水平且呈略微下降趋势,限制了种子油脂的合成积累。(3)沙棘非种子组织(果肉)和种子油脂合成积累的显著差异源于源基因GPD1和汇基因DGAT1协同表达的差异。本研究可为进一步培育果肉和种子含油量均高的沙棘良种提供科学参考。

文冠果种仁油脂脂肪酸形成的多基因协同调控

文冠果是中国北方重要的木本油料树种,种仁油脂富含油酸、亚油酸,特别是含有3%～5%其他食用植物油缺乏的神经酸。为探讨文冠果种仁油脂脂肪酸形成的基因调控机制,以品系‘12-03’4个不同发育期(6月22日, 7月6日, 7月19日, 8月1日)的种仁为材料,利用GC-TOF/MS (气相色谱飞行时间质谱)方法测定种仁油脂脂肪酸组份及不同组份的相对百分比;利用q RT-PCR分析种仁油脂脂肪酸形成相关基因KAR、EAR、HAD、FATA、FATB、SAD、FAE1、KCR、HCD、ECR、FAD2和FAD3的表达模式;分析不同基因表达对种仁油脂脂肪酸形成积累的影响。结果表明:(1)品系‘12-03’种仁成熟期油脂中油酸占29.87%、亚油酸占42.96%、神经酸占3.27%;种仁发育期间,油酸含量呈一直上升趋势,亚油酸含量呈先下降后上升趋势,神经酸呈先上升后下降趋势。(2) KAR、HAD和EAR基因的高表达协同FATA和FATB基因的低表达,为文冠果种仁油脂碳十八以上不饱和脂肪酸的形成积累提供了充足硬脂酸合成前体C16:0-ACP。(3)种仁成熟期前的SAD基因高表达催化硬脂酸快速去饱和为油酸,为C18:1以上不饱和脂肪酸形成提供了充足底物。(4)不同发育期种仁中FAE代谢通路的FAE1和KCR基因表达量均较低,HCD基因表达量在种仁成熟期前呈快速上升趋势;HCD基因是文冠果神经酸合成FAE代谢通路上的关键基因。(5)种仁发育期FAD2基因的持续高表达和FAD3基因的持续低表达促成种仁高积累亚油酸和低积累亚麻酸。SAD和FAD2基因的协同高表达促成文冠果种仁油脂富含油酸和亚油酸,而种仁成熟前期不断上升的HCD基因表达量促进了神经酸的合成积累。这不仅可为进一步理解文冠果种仁油脂脂肪酸合成积累的基因调控提供理论依据,而且对木本油料脂肪酸的遗传改良具有重要意义。

油茶种质倍性的SSR-PAGE和SSRseq鉴定

本研究采用流式细胞仪、SSR-PAGE和SSRseq相结合的方法,对97份油茶种质资源的染色体倍性进行了鉴定。结果表明:(1)以二倍体狭叶油茶为对照,流式细胞仪检测发现,在96份油茶种质中,29份是二倍体,58份是四倍体、9份是六倍体;(2)每份种质的56个SSR标记的SSR-PAGE扩增位点等位基因数表明,等位基因数最大为2的二倍体有22个,最大为4的四倍体有66个,最大为6的六倍体有9个,流式细胞仪检测的8个二倍体被校正为四倍体;(3)每份种质的56个SSR标记的SSRseq等位基因数鉴定的96份油茶种质染色体倍性结果与SSR-PAGE扩增位点等位基因数估测的结果一致。流式细胞仪可快速检测植物DNA分子量、SSR-PAGE可提供位点的最大等位基因数、SSRseq可精确获得等位基因数,三者结合是快速准确鉴定多倍性物种的染色体倍性的可靠技术与方法。

玉屏油茶炭疽病病原菌鉴定及同源性分析

油茶是贵州玉屏脱贫致富的重要产业,但近年来,炭疽病危害日益严重。为了防治油茶炭疽病,本研究采用林间病情观察、科赫氏法则验证、形态学鉴定及多基因分子鉴定的方法,对分离的3株炭疽病病原菌进行了系统鉴定。在ITS-CAL-GADPH 3基因所构建的系统发育树中,3株病原菌与ICMP10643*、ICMP-10646*两炭疽属模式菌株聚为一个独立的进化枝且置信度为99%,结合其形态特征,将其鉴定为山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)。依据林间观察结果与玉屏油茶的生长发育规律,提出了防治油茶炭疽病的关键时间。玉屏油茶炭疽病种类的分子鉴定可为抗病种质的分子育种及该病的防治提供科学依据。

紫斑牡丹种子高积累碳十八不饱和脂肪酸的多基因调控

为研究紫斑牡丹种子C18不饱和脂肪酸的高积累与相关基因SAD、FAD2、FAD3、FAD7和FAD8表达间的关系,以四个不同发育时期(6月20日, 7月7日, 7月17日和7月27日)的种子为材料,利用气相色谱飞行时间质谱测定种子油脂的脂肪酸组成,采用实时荧光定量PCR方法分析相关基因的表达模式,分析相关基因在不同发育期种子中的表达差异对种子油脂中碳十八不饱和脂肪酸积累的影响。结果表明:(1)紫斑牡丹种子油脂的不饱和脂肪酸占总脂肪酸的94.09%,其中碳十八不饱和脂肪酸占93.84%;不同种子发育期的油酸和亚麻酸呈一直上升趋势,而亚油酸则呈一直下降趋势;(2)种子发育过程中,KAR基因的持续上调表达合成了更多的C16:0-ACP;FATB和Δ9D基因下调表达,分别减弱了C16:0-ACP向棕榈酸和棕榈油酸的转化,KASⅡ基因的高表达促进了C16:0-ACP向C18:0-ACP的转化,为C18脂肪酸合成提供了充足原料;(3)种子发育过程中,SAD基因持续上调表达加快了种子中油酸的合成积累;FAD2基因表达量一直维持在相对较高水平,保证了种子油脂亚油酸占比一直在20%以上;发育初期FAD3基因表达量和发育末期FAD8基因表达量的迅速上升,加快了亚麻酸的合成。紫斑牡丹种子C18不饱和脂肪酸的高积累主要来源于SAD、FAD2、FAD3和FAD8基因的协同高表达。这为理解种子油富集碳18不饱脂肪酸的基因调控机制提供了理论依据,对木本油料油脂脂肪酸组份的遗传改良具有重要意义。

油茶种子油酸合成积累相关基因的表达模式分析

油茶是中国南方的重要木本油料树种,但其种子油富含油酸的多基因协同调控机制仍不清楚。以高油酸品系‘MY003’和低油酸品系‘MY008’的不同发育期(6月2日, 7月4日, 8月5日, 9月3日)种子为材料,利用三氟化硼—甲醇法对样品进行甲酯化,采用GC-TOF/MS方法测定所提取油茶种子油的脂肪酸组份及不同组份的相对百分比;采用qRT-PCR方法分析油酸合成积累相关基因KAR、HAD、EAR、KASI、KASII、FATB、SAD、FAD2等的表达模式,并分析油酸合成积累上下游基因表达对油茶种子富积油酸的影响。结果显示:品系‘MY003’和‘MY008’种子油中共检测出6种主要脂肪酸,其中油酸为主要组份,分别占总脂肪酸的82.51%和76.64%;种子发育期间,油酸含量一直呈上升趋势,棕榈酸、亚油酸和亚麻酸含量呈下降趋势,而硬脂酸和花生烯酸含量变化不明显。HAD、EAR和KASI基因协同高表达为油酸合成前体C16:0-ACP的合成提供了基础;FATB基因下调表达减弱C16:0-ACP向棕榈酸的转化,而KASII基因持续高表达为油酸合成提供了充足原料。SAD基因持续高表达及FAD2、FAD3、FAD7、FAD8和FAE1基因协同低表达,既加快油酸的合成积累,同时也降低了油酸的去饱和作用,这种上下游多基因的协同调控促成和保证了油茶种子油酸的高积累。本研究可为后续开展油茶种子油酸含量遗传改良研究提供科学依据。

沙棘3-磷酸甘油脱氢酶基因生物信息学及表达分析

沙棘果肉和种子组织中均富含生物活性油。3-磷酸甘油脱氢酶(GPD1)是促进油脂合成前体甘油-3-磷酸(G3P)合成的限速酶。本研究对沙棘HrGPD1基因进行生物信息学分析(氨基酸序列,保守域,亚细胞定位等),及其在沙棘不同组织(果肉和种子)中的表达情况。研究发现:HrGPD1开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域,存在多个磷酸化位点,定位于质体中,蛋白高级结构以α-螺旋为主,该蛋白序列与桑、梅、烟草和拟南芥的GPD表现出较高的序列相似性。qRT-PCR分析发现,HrGPD1基因在沙棘品系‘新俄3号’成熟种子和果肉中的相对表达量分别为0.52和1.35,与二者的含油率高低规律相一致。这为进一步研究HrGPD1基因在沙棘生物活性油合成过程中的作用机理提供科学依据。

沙棘种子发育期茉莉酸水平变化及其信号基因表达分析

为探讨沙棘种子发育期茉莉酸水平变化及其信号基因的表达模式,以品系‘56’不同发育期(7月10日, 7月26日, 8月11日, 8月27日)种子为试材,液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测五种内源激素(茉莉酸JA,生长素IAA,脱落酸ABA,赤霉素GA3,细胞分裂素tZ)含量,qRT-PCR分析JA合成代谢通路基因(DAD1,LOX, AOS, AOC, OPR3,β-氧化酶基因)及相关转录因子(TCP2, MYC2)和hrhmiR319e的表达模式。结果表明:(1)种子发育初期,内源激素IAA、tZ、GA3与JA含量最高,随后呈先下降后略有上升趋势;相反,ABA含量呈持续上升趋势;种子成熟期,高含量ABA在一定程度上抑制了其他4种激素合成,进而减缓种子生长发育速度,并促进种子成熟。(2)沙棘LOX、AOS和AOC基因表达量在不同种子发育期存在明显差异,最大值分别是最小值的3.4倍、4.8倍和18.8倍,是JA合成的关键基因。(3)沙棘hrhmiR319e负调控其靶转录因子TCP2,TCP2负调控下游JA代谢通路关键基因LOX的表达;MYC2正调控JA代谢通路关键基因AOS,负调控LOX和AOC基因表达。首次揭示了"hrhmiR319-TCP2-LOX"和"MYC2-AOS"模块协同调控沙棘不同发育期种子中的JA合成。这可为后续深入研究茉莉酸信号对沙棘种子发育及其生物活性成分合成的分子调节机制提供理论基础。

沙棘不同发育期种子粒重和大小基因表达的qRT-PCR分析

沙棘是中国北方重要的经济和水土保持树种,其低种子产量正严重制约着沙棘产业的健康发展,而到目前为止,未见调控沙棘种子粒重和大小基因表达的报道。本研究测定了沙棘‘TF-23’品系不同发育期(7月10日,7月26日,8月11日,8月27日)种子的粒重和大小,采用qRT-PCR方法检测了调控种子粒重和大小相关基因(调控大小:KLU,BB,IKU2和DA1;调控粒重:ABA2;调控粒重和大小:AP2,ARF2和ARF18)的表达模式,并分析了这些基因表达与种子发育间的关系。结果表明:(1)沙棘种子发育的7月10日至8月27日,体积呈逐渐减小趋势,粒重呈先增加后逐渐减小趋势,颜色从7月26日至8月11日间变化明显,由青色转变为深褐色。(2)调控沙棘种子大小和粒重的8个基因在种子不同发育期的表达量不同。调控粒重的ABA2呈先上调后下调的表达模式,并在7月26日和8月27日间的基因表达量相对较高,与同时期粒重相对较大相一致。调控种子大小的KLU和IKU2均呈先上调再下调后上调的表达模式,BB呈先下调后上调表达模式,DA1则呈先上调后下调表达模式;而调控粒重和大小的AP2、ARF2和ARF18均呈先下调后上调表达模式。这些结果可为后续开展沙棘种子遗传改良提供科学参考。

紫斑牡丹种子发育期油脂合成积累的源汇基因协同表达

为研究紫斑牡丹种子油脂合成积累与相关基因(GPD1, DGAT1和DGAT2)表达间的关系,以四个不同发育期(6月20日, 7月7日, 7月17日和7月27日)的种子为材料,氯仿甲醇法测定种子含油率,实时荧光定量PCR方法分析基因的表达模式,分析相关基因在不同发育期种子中的表达差异及其对油脂合成积累的影响。结果表明:(1)不同发育期紫斑牡丹种子含油率呈不断升高趋势,在6月20日至7月27日的38 d内,从4.21%上升到18.38%;(2)调控油脂合成的源基因GPD1和汇基因DGAT1与DGAT2在发育前期的紫斑牡丹种子中的表达呈快速上升趋势,且表达量均在7月7日达到最高值;随后源汇基因的表达均不断降低。紫斑牡丹发育前期种子中源(GPD1)汇(DGAT1和DGAT2)基因的协同高表达,既促进合成了更多的TAG前体G3P,又促进了TAG积累。源基因GPD1表达量增加了2.44倍,汇基因DGAT1和DGAT2分别增加5.16倍和3.83倍,促成种子含油量增加了2.77倍。这可为深入理解紫斑牡丹种子油脂合成积累提供理论依据,对后续开展高油紫斑牡丹的分子育种具有重要意义。

文冠果种仁发育期油脂合成积累的源汇基因协同表达

为探讨文冠果种仁油脂合成积累与源汇基因表达的关系,以品系‘12-03’4个不同发育期(6月22日,7月6日, 7月19日和8月1日)的种仁为材料,利用氯仿甲醇法测定含油率,q RT-PCR方法分析油脂合成源基因(GPD1)和汇基因(DGAT1, DGAT2)在种仁中的表达差异及其对文冠果油脂快速合成积累的影响。结果表明:(1)文冠果种仁发育期,含油率呈快速上升趋势,从6月22日到8月1日的40 d,由6.69%上升到45.10%;(2)源基因GPD1和汇基因DGAT1与DGAT2在种仁发育前期中的表达量均呈快速上升趋势,且GPD1和DGAT2的表达量在7月19日达到最高值;随后的种仁成熟期,GPD1表达量迅速降低,而DGAT1的表达量则略有上升。源基因GPD1在种仁发育前期高表达,促进合成更多的TAG前体G3P,而种仁发育成熟期高表达的汇基因DGAT1和DGAT2则促进了TAG的持续积累。文冠果种仁发育期的油脂快速合成积累源于调控油脂合成的关键源基因(GPD1)和汇基因(DGAT1)的协同高表达,源基因GPD1表达量增加2.11倍和汇基因DGAT1表达量增加4.63倍,促成种仁含油量增加6.2倍。本研究可为理解木本油料种子油脂快速合成积累机制提供理论依据。