基于tecVLP研究白叶藤天然衍生物抗CCHFV效果

目的通过构建克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)模拟病毒入胞、基因转录及蛋白翻译能力的病毒样颗粒(tecVLP)并建立细胞感染模型,研究白叶藤天然衍生物抗CCHFV的效果。方法首先通过反向遗传学系统构建CCHFV微基因组质粒(PSMART-LCK-vL-NanoLuc)及辅助质粒(PCAGGS-LCK-L、PCAGGS-M、PCAGGS-S、PCAGGST7),在此基础上利用共转染方式构建包含NanoLuc荧光素酶报告基因微基因组及所有结构蛋白的CCHFV tecVLP,利用qRT-PCR和Nano-Glo^(■)Luciferase Assay试剂盒检测被感染细胞中NanoLuc荧光强度及基因的相对表达,以此建立CCHFV tecVLP细胞感染模型。最后利用该模型研究白叶藤天然衍生物的抗CCHFV效果。结果经PCR验证后,微基因组质粒PSMART-LCK-vL-NanoLuc在560 bp左右检测到预期大小的目的条带;辅助质粒PCAGGS-T7在2800 bp左右检测到预期大小的目的条带;经双酶切鉴定后,辅助质粒PCAGGS-LCKF-L、PCAGGS-M以及PCAGGS-S分别在11000、5000和1600 bp处检测到预期大小的目的条带。电镜结果显示,在上清及细胞中均观察到了直径大小约50 nm的CCHFV tecVLP颗粒,滴度为105TCID50。与对照组比较,CCHFV tecVLP感染组细胞的NanoLuc荧光值和基因相对表达明显升高,差异均有统计学意义(t=80.63、28.35,P均<0.001)。上述结果表明成功建立了CCHFV tecVLP的细胞感染模型,并利用该模型进行后续研究。qRT-PCR结果显示,白叶藤天然衍生物在浓度为50和100μmol/L时,可显著降低已感染CCHFV tecVLP的Huh7细胞中NanoLuc基因的相对表达(t=32.59、34.43,P均<0.001);Nano-Glo^(■)Luciferase Assay试剂盒检测结果显示,白叶藤天然衍生物在浓度为50和100μmol/L时,亦可显著降低已感染CCHFV tecVLP的Huh7细胞中NanoLuc荧光强度(t=152.60、182.00,P均<0.001)。根据Auto Dock评分显示,白叶藤天然衍生物(Z24)与CCHFV-核衣壳蛋白(NP)结合能为-6.42 kcal/mol,绝对值>5,结合度良好,稳定性较强。结论白叶藤天然衍生物对CCHFV tecVLP具有明显的抑制效果,该抑制效果主要作用于病毒复制周期的转录及翻译阶段。