人工养殖半滑舌鳎卵巢发育及其产卵类型研究

研究了人工养殖半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）卵巢发育组织学的季节变化及其与性成熟系数（gonadosomatic index，简称GSI）和肝质量指数（hepatosomatic index，简称HSI）的关系。结果表明，半滑舌鳎成熟鱼卵巢发育经历Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期、Ⅴ期、Ⅵ期，再到重复发育Ⅱ期；人工养殖条件下，3～5月份大部分鱼卵巢处于Ⅱ期，从6月份开始，其卵母细胞内开始沉积卵黄颗粒，9～11月份，卵母细胞内卵黄颗粒充盈整个胞质，基本达到生长成熟，排卵后至翌年2月份，卵巢进入了退化吸收Ⅵ期或重复发育Ⅱ期；繁殖期GSI达到最高峰；产卵后或重复发育Ⅱ期，GSI显著下降，此时HSI显著升高至全年最高峰；半滑舌鳎在1a中只有1个繁殖期，进行分批产卵。

绿鳍马面鲀重复发育雄性生殖腺结构与发育组织学观察

采用常规石蜡切片、HE组织染色法研究了性成熟绿鳍马面鲀雄性生殖腺结构和发育组织学。结果表明,性成熟绿鳍马面鲀精巢从外形上明显分为上、下两段,上段为生精部,下段为贮精囊。生精部分为2支,呈黄色、长条状;生精部为典型的小叶型结构;精小叶间有间质(Leydig)细胞。其生精部的发育历程可分为重复发育Ⅲ期、精子形成Ⅳ期、精子成熟Ⅴ期和退化吸收Ⅵ期。贮精囊位于精巢的后方并通过壶腹与生精部相连,贮精囊为椭圆形,白色不分支,其组织结构与贮存精子功能相适应,由许多被结缔组织分开的管状囊腔组成;贮精囊组织学变化与生精部周期性的变化相关,又有相对的独立性,也有周期发育,可分为恢复期、生殖期和退化期。

条斑星鲽CYP19a基因克隆及其在雄鱼生殖周期中的表达

细胞色素P450芳香化酶(P450arom)作为P450细胞色素酶超家族中的一员,是性类固醇生成途径中的末端酶,能够将雄激素转化为雌激素。在大多数脊椎动物中,P450arom由CYP19单基因编码。但是在鱼类中存在两种P450芳香化酶,分为性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB),它们由不同的基因(CYP19a和CYP19b)编码,分布在不同的组织。通过简并引物扩增及RACE cDNA扩增克隆,在国内外首次获得全长为2167bp的条斑星鲽CYP19a cDNA序列,并将推测的氨基酸序列与其它物种P450arom氨基酸序列进行多重比较,发现存在跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。通过RT-PCR分析了P450aromA mRNA在条斑星鲽不同组织中的表达情况,结果表明,CYP19a基因主要在脑、卵巢和精巢中表达,其次在肠、肝脏、肾脏也有少量表达。同时也分析了P450aromA mRNA在处于不同发育期的精巢中的表达情况,发现在Ⅱ期精巢中表达量最高,在Ⅴ期精巢中表达量最低。

雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Hali-choeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%。组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异。肾中表达量最丰富,鳃中最少。根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)促性腺激素受体在雄性生殖周期中的表达

采用RT-PCR方法,研究了促性腺激素受体(FSHR和LHR)基因在雄性半滑舌鳎繁殖周期中的季节表达规律。结果表明,FSHR mRNA在雄鱼精巢、脑和脾中及LHR mRNA在雄鱼的精巢和脾中均呈季节规律性变化。3月份样品中,FSHR mRNA在精巢表达量最低,12月份,表达量最高;FSHR mRNA在脑中表达模式与精巢相反,3月份表达量最高,12月份达到最低值;FSHR mRNA在脾中表达模式和精巢相同。在6月份精巢样品中,LHR mRNA表达量最低,12月表达量最高;在脾中,LHRmRNA在3月份表达量最低,12月份表达量最高。在精巢中,FSHR mRNA和LHR mRNA都是在排精时表达量达到最大值,说明这两种受体在雄性半滑舌鳎排精时发挥重要作用。

许氏平鮋精巢的形态结构与发育组织学

采用组织学方法系统研究了许氏平鮋Sebastes schlegeli精巢的形态结构和发育组织学。结果表明,许氏平鮋精巢属于小叶型,精细胞发育经历初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子6个发育阶段。5月到7月,许氏平鮋精巢处于精原细胞增殖期和初级精原细胞分裂增殖,产生次级精原细胞,次级精原细胞和支持细胞组成精小囊;9月到11月进入精子发生期,精小囊中的生殖细胞进一步发育,逐渐形成精子;翌年1月到3月是精子退化吸收期,精巢中仅有初级精原细胞和残余的精子。性成熟系数(GSI)在精子发生晚期(Ⅳ期)达到全年最高峰值,雄鱼肝重指数(HSI)在退化吸收期(Ⅴ期)达到最高峰值。

半滑舌鳎促滤泡激素受体基因克隆及其在雌鱼生殖周期中的表达

通过简并引物扩增及RACE技术,首次克隆了半滑舌鳎促滤泡激素受体(FSHR)基因cDNA全长序列。该基因全长3105bp,编码704个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TMhelix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族。该基因编码区共有19个Ser,4个Thr和5个Tyr磷酸化位点;3个潜在的N基端糖基化位点,分别是62NISS,226NGIK和356NSTS;441T为潜在的PKC位点。基酸序列比对结果表明,半滑舌鳎FSHR含有GpHR家族的特殊信号序列,如82CCAF,481ERW,594FTD和667NPFLY,含有10个LRRs(LRR1-10)。组织表达分析表明,FSHR表达广泛,除在性腺中大量表达外,其他非性腺组织也有表达,尤其以脾、肾、头肾表达最较高。采用125Ⅰ标记放射免疫分析法(RIA)测定雌鱼血清中E2含量的季节变化,发现4月时E2含量最低,10月时含量最高。卵巢中FSHR mRNA在10月表达量最高,1月最低。

雄性半滑舌鳎贮精囊形态结构与内分泌功能初步研究

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国名贵海水养殖鱼类之一,其独特的生殖生物学特性受到国内外学者关注。本文以山东半岛养殖半滑舌鳎为对象,侧重研究贮精囊形态结构,以及雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)在不同精巢发育期贮精囊中的免疫组织化学定位。结果表明:精巢前端为贮精囊,其长度与生精部几乎等长,当精巢接近性成熟和性成熟时贮精囊非常饱满;贮精囊由结缔组织隔膜分割成小室,在生殖期间小室内有大量的成熟精子;AR和ER阳性反应部位主要发生在贮精囊小室间的结缔组织细胞和间质细胞内,在精巢重复发育期和排精后,贮精囊被膜和隔膜呈现强AR和ER阳性反应;精子形成期和成熟期,贮精囊被膜和隔膜呈弱AR和ER阳性反应。AR和ER可能介导半滑舌鳎贮精囊黏液、酶类、蛋白质合成与分泌作用。

半滑舌鳎促黄体激素受体基因片段的克隆及组织表达分析

采用巢式RT-PCR法克隆了半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis促黄体激素受体(Luteinizing Hormonene Recep-tor,LHR)基因部分序列,经过BLAST比对,认为该序列与庸鲽、牙鲆、黑鲷、尼罗罗非鱼、青鳉和红鳍东方鲀的LHR基因同源性分别为97%,94%,85%,83%,82%和80%。该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,含有典型的跨膜螺旋结构区域(TM helix),属于糖蛋白激素受体(GHR)家族。组织表达分析表明,LHR基因在半滑舌鳎的卵巢、精巢、肝脏、胃、肠、鳃、心、脾、肾、头肾和脑中均有表达,表达量有所不同,以脾和肾中表达量最丰富。