TRIM44沉默对肝癌细胞增殖的影响及分子机制研究

目的:研究三结构域蛋白44(tripartite motif-containing protein 44,TRIM44)对肝癌细胞增殖的影响并探讨其分子机制。方法:RT-q PCR和Western blot法分别检测TRIM44在正常肝组织、肝癌组织和癌旁组织,以及永生化肝细胞和肝癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平;在肝癌细胞中转染靶向沉默TRIM44的shRNA,Western blot实验检测对TRIM44的沉默效果;MTS实验分析TRIM44沉默对肝癌细胞活力的影响,Ed U标记实验检测TRIM44沉默对肝癌细胞DNA合成能力的影响;软琼脂集落形成实验检测TRIM44沉默对肝癌细胞锚定非依赖生长能力的影响;Western blot法检测TRIM44沉默对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)总蛋白及磷酸化水平的影响;用m TOR激活剂MHY1485处理TRIM44沉默的肝癌细胞,并通过MTS实验分析肝癌细胞的活力。结果:TRIM44的mRNA和蛋白水平在肝癌组织中高于癌旁组织和正常肝组织,TRIM44的mRNA和蛋白水平在肝癌细胞系中高于永生化肝细胞;TRIM44沉默可抑制肝癌细胞的活力、DNA合成能力及锚定非依赖生长能力;TRIM44沉默可降低m TOR磷酸化水平,MHY1485拮抗TRIM44沉默对肝癌细胞活力的抑制作用。结论:TRIM44沉默可能通过下调m TOR活性抑制肝癌细胞增殖。

Clusterin基因沉默对脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响

目的:研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默簇集蛋白(clusterin,CLU)基因表达对人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的影响。方法:设计和合成靶向CLU的短发夹RNA(short hairprin RNA,shRNA)序列(CLU shRNA1,CLU shRNA2),并构建到慢病毒的载体plentilox 3.7,以不针对任何基因的shRNA序列作为对照(对照shRNA)。包被能成功表达各种shRNA载体的慢病毒。将慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞,Real-time PCR法和Western blot法测定CLU mRNA表达和蛋白质表达水平,证实干扰效果。给予不同放射剂量(2、4、6 Gy)处理后,通过四甲基偶氮唑盐(thiazolyl blue tetrazolium bxomide,MTT)法及流式细胞仪Annexin V/PI法检测脑胶质瘤U87细胞的存活率及凋亡率。Western blot方法筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:靶向CLU基因的shRNA特异性地抑制了CLU mRNA和蛋白质的表达。MTT实验结果显示实验干扰组细胞在不同放射剂量下的脑胶质瘤实验U87细胞的存活率与对照组比较明显下降,差异具有统计学意义(4 Gy时,对照shRNA vs.CLU shRNA1:P=0.000,对照shRNA vs.CLU shRNA2:P=0.003;6 Gy时,对照shRNA vs.CLU shRNA1:P=0.000,对照shRNA vs.CLU shRNA2:P=0.000)。流式细胞仪Annexin V/PI法检测结果表明:4 Gy放疗后2个实验组细胞凋亡率均明显增加,最高达(35.54±0.95)%,较对照组高2倍多,差异具有明显统计学意义(对照shRNA vs.CLU shRNA1:P=0.000;对照shRNA vs.CLU shRNA2:P=0.000)。Western blot法发现CLU沉默可以显著上调促凋亡分子Bax蛋白水平。结论:CLU基因沉默可能通过调控Bax蛋白的表达,明显增强脑胶质瘤U87细胞对放射的敏感性,有望成为增加脑胶质瘤放射敏感性的新靶点。

诺和锐30三餐前注射和胰岛素泵短期强化治疗2型糖尿病疗效比较

目的探讨门冬胰岛素（诺和锐）30三餐前注射和胰岛素泵强化治疗血糖控制欠佳的2型糖尿病（T2DM）患者疗效、安全性及性价比。方法将62例T2DM患者随机分为诺和锐30注射组（诺和锐30组）和胰岛素泵组（CSⅡ组）,诺和锐30组采用每日早、晚餐前常规注射且中餐前加注4～8单位诺和锐30,CSⅡ组采用胰岛素泵持续皮下输注诺和锐,疗程4周。观察两组治疗前、后血糖和糖化血红蛋白（HbA1c）水平、两组达到相同血糖水平所需治疗时间、胰岛素日用量及低血糖发生率等。结果诺和锐30组和CSⅡ组治疗均有效,空腹血糖、餐后2h血糖及HbA1c均较治疗前明显下降,两组达到相同血糖水平所需治疗时间及低血糖发生率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论诺和锐30三餐前注射能有效模拟人生理胰岛素分泌,有效控制高血糖,作用与胰岛素泵相当,且效价比高于胰岛素泵。

预混门冬胰岛素30和预混人胰岛素30R治疗2型糖尿病的对比研究

目的:探讨每日2次注射预混门冬胰岛素30(诺和锐30)和预混人胰岛素30R(诺和灵30R)治疗2型糖尿病患者的疗效和安全性。方法:68例经口服降糖药物控制不佳的2型糖尿病患者被随机分为诺和锐30治疗组和诺和灵30R治疗组,分别采用每日早,晚餐前注射诺和锐30和诺和灵30R,进行为期12周的观察。比较两组患者糖化血红蛋白(HbA1c),7个时点血糖,低血糖发生频率等。结果:诺和锐30治疗组的早,晚餐后血糖明显低于诺和灵30R治疗组(P<0.01);诺和锐30治疗组低血糖发生次数低于诺和灵30R治疗组,但差异无统计学意义(P>0.05),诺和锐30治疗组无严重低血糖发生。结论:对于2型糖尿病患者,每天2次注射诺和锐30较诺和灵30R能更明显地降低餐后血糖及减少低血糖风险,同时更易于为患者接受。

红景天苷调节Nrf2/ROS通路增强U-251MG的放射敏感性

目的:探究红景天苷(SD)对人星形胶质瘤细胞U-251MG放疗敏感性的影响及相关的分子机制。方法:将U-251MG细胞随机分成4组:对照组、红景天苷单独处理组(SD)、放疗组和放射+SD组。SD组和放射+SD组加50 nmol/L红景天苷处理,放疗组和放射+SD组给予10 Gy、6 MV X射线照射。细胞增殖试剂盒(CCK8)检测0、1、2、3、4 d细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡情况。蛋白质印迹检测B淋巴细胞瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、核因子E2相关因子(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)和还原型辅酶/醌氧化还原酶(NQO-1)的表达。氧化应激相关试剂盒检测活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)的活性。脑立体定向注射U-251MG建立原位移植瘤裸鼠模型,接种1周后,将20只雄性裸鼠随机分成4组,每组5只。SD组和放射+SD组裸鼠腹腔注射50 nmol/kg的红景天苷,放疗组和放射+SD组裸鼠给予X射线照射。28 d后检测肿瘤重量,免疫组化检测Ki67和PCNA的表达。结果:与对照组相比,SD组和放疗组细胞增殖速率显著降低;凋亡细胞数目明显增加;Bcl-2表达显著下调,Bax的表达显著上调;ROS和MDA的含量显著升高,SOD和Gpx的活性显著降低;Nrf2和NQO-1的表达变化无显著差异,HO-1的表达显著下调;SD组和放疗组体内实验中肿瘤重量显著降低,Ki67和PCNA的表达显著下调。放射+SD组与SD组和放疗组相比,细胞增殖速率显著降低;凋亡细胞数目明显增加;Bcl-2表达显著下调,Bax的表达显著上调;ROS和MDA的含量显著上升,SOD和Gpx的活性显著降低;Nrf2、HO-1和NQO-1的表达显著下调;放射+SD组体内实验中肿瘤重量显著降低,Ki67和PCNA的表达显著下调。结论:红景天苷可能通过调节Nrf2/ROS通路,增强人星形胶质瘤U-251MG的放射敏感性。

三维适形放疗联合动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌的疗效观察

目的探讨三维适形放疗联合经导管肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌的临床疗效。方法随机将2008年11月至2011年11月住院治疗的130例原发性肝癌患者分为对照组和观察组,每组各65例。对照组患者行经导管肝动脉化疗栓塞治疗,观察组患者在三维适形放疗后再行经导管肝动脉化疗栓塞治疗,比较两组患者临床疗效和药物不良反应情况。结果观察组患者总有效率(78.5%)明显高于对照组的(61.5%),差异有统计学意义(P<0.05);而对照组和观察组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论三维适形放疗联合经导管肝动脉化疗栓塞治疗原发性肝癌疗效确切,安全高效,不良反应少。

microRNA-21、MMP-9在非小细胞肺癌发病机制中的作用

为了探讨微小核糖核酸-21（microRNA-21）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义，本研究选取2015年2月至2017年3月我院病理科保存的NSCLC组织72例，同时选取同标本癌旁组织（距肿瘤边缘〉5cm）作为对照，采用实时荧光定量PCR检测microRNA-21表达，免疫组化染色法检测MMP-9表达。结果显示：NSCLC组织microRNA-21表达水平为0．157±0．054，明显低于癌旁组织（p〈0．05），而MMP-9阳性表达率为73．61％，明显高于癌旁组织（p〈0．05）；中低分化患者microRNA-21表达为0．136±0．044，明显低于高分化患者（p〈0.05），而MMP-9阳性表达率为86．36％，明显高于高分化患者（p〈0．05）；有淋巴结转移患者microRNA-21表达为0．140±0．050，明显低于无淋巴结转移患者（p〈0．05），而MMP-9阳性表达率为86．67％，明显高于无淋巴结转移患者（p〈0．05）；microRNA-21和MMP-9呈负相关（rs=-0.327,p〈0.05）。本研究表明，microRNA-21在NSCLC中低表达，而MMP-9表达升高，二者呈负相关且与NSCLC临床病理特征有一定关系。

Oct4在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响

探讨转录因子Oct4(octamer-binding transcription factor 4)在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭性的影响。该研究选取27例乳腺癌组织病人的肿瘤组织及癌旁组织,通过Western blot方法检测Oct4的蛋白水平。通过慢病毒介导的是shRNA干扰技术靶向沉默oct4基因的表达,Westernblot方法验证oct4基因沉默效果。细胞划痕实验和细胞侵袭实验检测oct4沉默对细胞迁移及侵袭能力的影响。Western blot检测oct4沉默对上皮–间质转化(EMT)的多个标志物的影响。结果显示,74%病人(20/27)中Oct4蛋白在乳腺癌组织的表达显著高于癌旁组织。慢病毒介导的shRNA能显著抑制细胞Oct4蛋白的水平。oct4基因沉默能抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力。oct4沉默后上皮细胞标志物E-cadhrin、alpha-catenin明显上调;而间质细胞标志物vimentin、N-cadherin则明显下降。以上结果表明,Oct4蛋白在乳腺癌组织的表达明显增高;oct4沉默可以显著抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。