腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达。万法:将人源性的VEGF165 cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达。结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610 bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108pfu／ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达。结论:成功构建了表达人VEGF165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础。

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的 :构建以鼠心肌轻链蛋白基因 (mlc- 2 v)为启动子、携带人血管内皮生长因子 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒载体 ,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性。 方法 :酶切腺病毒载体 PDC31 5自身启动子 CMV,构建腺病毒载体PDC31 7,分别接入 h VEGF1 6 5、mlc- 2 v基因 ,构建腺病毒载体 PDC- mlc- h VEGF1 6 5。鉴定正确后 ,将 PDC- mlc- h VEGF1 6 5与 L ipo-fectam ine共转染至 2 93细胞 ,经同源重组获得以 m lc- 2 v为启动子、携带 h VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 Ad- m lc- h VEGF1 6 5,同步构建无靶向性的重组腺病毒 Ad- h VEGF1 6 5。扩增并测定滴度后 ,Ad- h VEGF1 6 5、Ad- mlc- h VEGF1 6 5分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞 ,利用 EL ISA、Western印迹分析等方法检测 Ad- mlc- h VEGF1 6 5转染心肌细胞的靶向性。 结果 :构建的病毒正确 ,病毒滴度为 2 .8× 1 0 9pfu/ ml。转染 3d后 ,Ad- h VEGF1 6 5组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到 VEGF的表达 ,而 Ad- mlc- h VEGF1 6 5组仅在心肌细胞中有 VEGF的表达 ,且 Ad- m lc- h VEGF1 6 5组心肌细胞分泌的 VEGF要少于 Ad-h VEGF1 6 5组。结论 :成功构建了以 mlc- 2 v为启动子、携带人 VEGF基因的重组腺病毒 Ad- m lc-

血管内皮生长因子基因重组腺病毒载体的构建

目的 :构建携带人血管内皮生长因子基因的重组腺病毒载体。方法 :将人源性的 VEGF1 6 5c DNA正向插入到穿梭质粒 p HCMVSP1A的 CMV启动子之下 ,构建重组质粒 ,通过脂质体与 p JM17共转染 2 93细胞 ,经同源重组获得携带人 VEGF1 6 5基因的重组腺病毒 ,通过 PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒 ,扩增、纯化并测定滴度。结果 :人VEGF1 6 5c DNA成功地正向插入到 p HCMVSP1A载体中 ,以重组病毒基因组 DNA为模板 ,同时扩增出 5 76 bp的VEGF1 6 5c DNA基因片段和 86 0 bp的腺病毒骨架基因片段 ,证实了所构建病毒的正确性 ,病毒滴度为 2 .5× 10 9pfu/ m l。结论 :成功构建了表达人 VEGF1 6 5基因重组腺病毒载体 ,使

不同年龄大鼠心肌中CNTF表达的免疫组织化学研究

目的 :为了解睫状神经营养因子 ( CNTF)在大鼠生后心肌中的表达变化。方法 :用免疫组织化学法和计算机图像处理系统 ,研究 1天龄、1月龄、2月龄、3月龄、2年龄大鼠心肌中 CNTF免疫反应的变化。结果 :在各年龄组中均存在阳性免疫反应 ,阳性免疫反应见于心肌细胞膜上 ,各年龄组的平均灰度值分别为 2 5 .12± 0 .5 4、5 0 .12± 0 .6 7、5 7.2 5± 0 .6 2、43 .81± 0 .83、3 2 .14± 0 .73。结论 :睫状神经节因子在出生后的心肌细胞内即存在 。

骨形态发生蛋白-4基因重组腺病毒载体的构建

目的:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建携带人骨形态发生蛋白-4基因的重组腺病毒载体(Ad.BMP4)。方法:根据GenBank获得BMP4的基因序列合成引物,经PCR扩增获得长度为1230bp的BMP4基因片断,经酶切、测序鉴定后,与腺病毒穿梭质粒pSuCMV连接,随后与5'缺陷型腺病毒右臂的质粒pBGHloxPΔE1E3通过脂质体Lipofectamine2000共转染至293细胞,获得重组腺病毒Ad.BMP4,并予以扩增、纯化、鉴定。结果:经酶切电泳和测序证明获得的BMP4基因片断序列、大小和方向正确,目的基因插入的位置、方向正确,经重组、扩增和纯化后获得病毒滴度为2.9×109pfu/ml的重组腺病毒Ad.BMP4,以PCR扩增和测序的方法证实了所构建病毒含有目的基因的片断,安全性检测证明所构建的腺病毒无野生性腺病毒的存在。结论:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建了腺病毒Ad.BMP4。采用的腺病毒载体点特异性重组的方法极大地提高了包装成功率,且包装成功的病毒颗粒均为含有目的基因的重组病毒,从而保证了重组过程的快速和高效。

组织工程心脏瓣膜体外脉动反应器的初步研制

目的:探讨自行研制的体外脉动反应器应用于组织工程心脏瓣膜应力预适应的可行性。方法:根据流体力学原理,采用特殊材料自行设计制作了体外脉动反应器和预适应应力培养系统;将生物瓣置于反应器中运转,观察生物瓣的工作状态和系统的稳定性。以脱细胞猪主动脉瓣作支架,新生牛主动脉内皮细胞作种子细胞构建组织工程心脏瓣叶,静态培养4 d后,置入反应器内进行预适应处理24 h(流量由30 ml/min调至400 ml/min,频率30次/min),观察内皮细胞残留情况,并与静态培养的瓣膜相比较。结果:预适应应力培养系统能产生搏动性液体流,生物瓣正常工作,运转7 d,系统状态稳定。静态培养成功构建组织工程心脏瓣膜,内皮细胞与瓣叶支架黏附紧密,沿瓣叶表面形成单层细胞层,生长状态良好;动态培养的瓣叶内皮细胞部分被冲刷脱落,但仍有少部分细胞(6.26％)残留黏附。结论:自行设计和构建的体外脉动反应器基本能模拟体内心脏瓣膜的血流动力学,用于组织工程心脏瓣膜预适应研究具有可行性。

体外培养的施万细胞在平面和聚乙醇酸纤维网架上的迁移

目的 观察培养的施万细胞 (SCS)在平面或聚乙醇酸 (PGA)纤维的立体网架上迁移特性。 方法 用光、电镜技术观察在不同培养环境和培养时间中 ,SCS在平面或立体网架上的形态变化。 结果 平面上 SCS一般为长梭形 ,同群细胞间以突起相连接 ;同群细胞迁移有方向和速率一致的特征。立体网架上细胞有球形和长橄榄形两种 ,细胞间也互相接触 ;细胞迁移速度快于平面 ,纤维上的长橄榄形细胞快于球形细胞 ;长橄榄形细胞长轴往往与纤维呈一定夹角 ,有包裹纤维的趋势。 结论 PGA在 SCS生长中具有良好的生物相容性 ;与平面相比 SCS更易在立体网架的纤维上迁移 ,长橄榄形的 SCS有包裹纤维的趋势。

老年肺肿瘤患者术后综合呼吸功能训练的康复效果

目的探讨综合呼吸功能训练对老年肺肿瘤患者术后肺部并发症的发生率、胸管留置时间、术后住院天数的影响,确定老年肺肿瘤患者术前及术后呼吸功能训练方法。方法便利抽取胸外科老年肺肿瘤患者60例为研究对象,按随机数字表法将其随机分为实验组与对照组,每组30例。所有患者均接受责任护士给予的常规护理,实险组的患者增加一对一的综合呼吸功能训练干预措施。结果两组研究对象术后并发症的发生率、胸管留置时间及术后住院天数的差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)综合呼吸功能训练可以有效降低老年肺肿瘤患者术后肺部并发症的发生率、缩短胸管留置时间与术后住院天数。(2)由有效咳嗽、腹式呼吸、缩唇呼吸和节段呼吸训练组成的综合呼吸功能训练适合老年肺肿瘤患者的掌握与应用,能有效提高老年肺肿瘤患者术后的康复效果。

Livin在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的:探讨凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员Livin及其两种异构体Livinα和Livinβ在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与NSCLC临床病理的关系。方法:采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测NSCLC组织中Livinα mRNA和LivinβmRNA的表达。结果:58例NSCLC组织中Livin mRNA表达阳性率为74.1%,而在癌旁组织低表达(5.1%,P<0.01)。Livin mRNA表达与患者年龄,病理分型、肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期均无明显相关关系。结论:Livin在非小细胞肺癌组织中特异性地高表达,可能与肿瘤的发生、发展密切相关,可能成为诊断和治疗的新靶点。

背根神经节与聚乙醇酸联合培养的形态学观察

探索人工生物降解材料聚乙醇酸纤维与周围神经组织的生物相容性。取新生ＳＤ大鼠背根神经节与人工材料聚乙醇酸纤维联合培养３周，倒置显微镜与扫描电镜观察。神经元的突起与雪旺细胞可贴附在聚乙醇酸纤维上生长，并呈串珠状地环绕着人工聚乙醇酸纤维。体外联合培养结果提示，人工生物降解材料聚乙醇酸与大鼠周围神经组织有较好的生物相容性。

综合呼吸功能训练对老年肺肿瘤病人术后呼吸功能的影响

目的通过对老年肺肿瘤手术病人进行综合呼吸功能训练,观察呼吸功能训练对病人术后呼吸功能状况的影响。方法便利抽取老年肺肿瘤手术病人60例,随机分为观察组30例与对照组30例。对照组研究对象给予常规护理,观察组除给予常规护理外,自入院第2天至术后第7天还给予一对一的综合呼吸功能训练干预措施。结果观察组术后第3—第7天的主观呼吸功能障碍程度评分均较对照组下降(P<0.05);观察组术后第3天与第7天VC%、FVC%、FEV1%3项肺功能指标值及动脉血氧分压均明显高于对照组(P<0.05)。结论综合呼吸功能训练能够改善老年肺肿瘤病人术后呼吸功能状况,提高术后动脉血氧分压,但是对术后动脉血二氧化碳分压没有影响。

热疗对肺癌A549细胞P-糖蛋白表达影响的实验研究

目的研究不同温度、不同加热时间下热疗对肺癌A549细胞P-糖蛋白(P-gp)表达的影响,为肺癌的热疗和热化疗提供理论依据。方法体外复苏与培养肺癌A549细胞;对照组37℃下培养,实验组按不同时间、不同温度分组水浴加热肺癌A549细胞后培养24 h,采用流式细胞术(FCM)观察热处理后的肺癌A549细胞株P-gp表达的变化。结果流式细胞术显示各热疗组A549细胞的P-gp的表达率均较对照组下降,且P-gp的表达率与加热的时间和温度均呈负相关。结论热疗可以抑制P-gp的表达,可能是逆转肿瘤细胞多药耐药的一种手段。

长春新碱对非小细胞肺癌中Livin基因表达的影响

目的:研究化疗药物长春新碱(Vincristine,VCR)对人肺癌细胞株A549生长的抑制作用以及Livin基因表达的变化。方法:将VCR按100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/ml浓度加入A549后,分别作用24、48、72小时,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率;实时荧光定量PCR检测LivinmRNA的表达,免疫印迹法(Westernblot法)检测Livin蛋白的变化。结果:VCR对A549具有一定增殖抑制作用,呈时间和剂量依赖性。VCR早期可抑制A549中Livin基因表达,作用72h后Livin基因表达量开始增加。结论:VCR可抑制A549肺癌细胞的增殖,在一定时间内呈剂量、时间依赖性。VCR可能诱导了Livin基因的表达,Livin可能参与了肺癌细胞对VCR的耐药机制。。

脂质体介导人钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞及其蛋白表达(英文)

目的:研究人钠/碘同向转运体(NIS)基因转染肺癌细胞及其蛋白表达。方法:将体外培养的肺癌A549细胞分为实验组和对照两组:以脂质体Lipofectamihe2000为载体,分别介导转染重组质粒pcDNA3-hNIS和空质粒pcDNA3。NIS基因重组质粒pcDNA3-hNIS进行扩增、纯化,并经酶切鉴定和DNA测序。采用Western Blot法和免疫组化法分别检测转染肺癌细胞中NIS蛋白表达。结果:酶切鉴定和DNA测序结果表明重组质粒pcDNA3-hNIS中插入的hNIS基因片段大小、方向正确。WesternBlot法和免疫组化染色结果显示实验组有NIS蛋白表达,其阳性率达70.6%且主要分布于细胞膜而对照组无表达。两组比较有显著性差异(P=0.000)。结论:脂质体Lipofectamine 2000介导转染人钠/碘同向转运体基因pcDAN3-hNIS肺癌细胞能够成功地表达NIS蛋白。

对中国农业保险发展的思考

一．我国农业保险发展现状 二十多年来，农业保险累计赔付73．9亿元。目前已形成“五种模式、四种形式”进行商业性保险公司经营政策性业务试点，显现良好的发展势头。2005年农业保险保费收入达7．29亿元，初步扭转了自1994年以来农业保险逐步萎缩的局面。2006年，全国实现农业保险保费收入8．46亿元，同比增长13％；赔款支出5．84亿元，农业保险保额达733．21亿元。

微孔板杂交法检测肺癌端粒酶活性的研究

目的 :研究肺癌端粒酶活性及其临床应用价值。方法 :采用端粒重复序列扩增—微孔板杂交法 ,对 10 0例切除肺癌标本 ,分别取癌中央组织、癌旁 1cm、远癌组织 3块组织 ,进行端粒酶活性分析 ,同时送病理检查。结果 :端粒酶在肺癌组织中央部位的阳性检出率为 10 0 % ,癌旁 1cm为 84% ,远癌组织为 8% ,不同病理类型的肺癌端粒酶活性水平 ( A/mg蛋白 )分别为 :鳞癌 2 8例 0 .12 2 ,腺癌 6 8例 0 .12 5 ,小细胞癌 4例 0 .12 7,无显著性差异。结论 :端粒酶活性在切除肺癌标本中的测定 。

人钠/碘同向转运体基因转染肺癌A549细胞介导放射性碘摄取实验研究

目的:研究重组人钠/碘同向转运体基因(hNIS)腺病毒介导肺癌A549细胞的碘摄取、外流和杀伤情况,为放射性碘治疗肺癌提供理论和实验依据。方法:用重组hNIS腺病毒(AdNIS)感染肺癌A549细胞,检测感染细胞内hNIS蛋白的表达;在体外培养的条件下研究其125I的摄取、外流情况以及131I的杀伤情况。结果:hNIS蛋白在实验组肺癌A549细胞中表达阳性且主要分布于细胞膜上;实验组细胞摄碘能力较对照组高;细胞摄碘后碘外流过程十分迅速;实验组细胞可被131I有效杀伤。结论:应用腺病毒为载体,可以有效的将hNIS基因转染至体外培养的肺癌A549细胞中,并介导肺癌细胞对放射性碘的摄取及选择性杀伤作用。