2015-2020年FAdV-4安徽流行株全基因组测序分析及不同感染途径的致病性研究

为探讨血清4型禽腺病毒(FAdV-4)安徽流行株的基因组遗传变异特征及其感染途径与致病性的关系,选择2015-2020年6株FAdV-4安徽分离株进行全基因组测序与分析,并以CH/AHMC/2015株对10日龄SPF鸡进行不同感染途径(皮下注射、口服、点眼、滴鼻及其分别同群混养)的致病性试验。结果显示,6株FAdV-4安徽分离株的基因组全长均为43 719~43 723 nt,其核苷酸同源性达99.97%,与国内FAdV-4主要流行株同源性为99.56%~100%,与国外经典毒株ON1、KR5、MX-SHP95同源性为98.45%~98.78%;6株病毒与国内代表株HB1510具有13个核苷酸位点差异,并导致5个位点氨基酸变化,与国外经典毒株存在特征性差异。氨基酸分析显示,Hexon蛋白aa188、Fiber-2蛋白aa219和aa3803个氨基酸位点存在一定的特征性,致病株主要为R、D、T,非致病株主要为I/V、G、A。进化分析显示,国内FAdV-4流行株与巴基斯坦、印度分离株的遗传关系最近。感染试验显示,皮下注射、口服、点眼、滴鼻4组人工感染鸡的发病率和死亡率分别为100%、55%、50%、60%和90%、20%、40%、50%,各组同群混养鸡的发病率为20%~40%,仅皮下注射组混养鸡出现死亡,死亡率为20%。结果表明,2015-2020年FAdV-4安徽省流行株具有国内主要流行致病株特征,其不同感染途径的结果进一步揭示该病的临床流行特点,为该病防制提供科学依据。

基因2型鹅星状病毒EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR的建立与应用

目的:建立快速、灵敏、特异的基因2型鹅星状病毒(Goose astrovirus 2,GoAstV-2)检测方法。方法:以GoAstV-2 ORF2基因为靶标,设计特异性检测引物并构建含目标基因的重组质粒作为阳性质粒标准品,以其为模板优化建立一种EvaGreen饱和染料荧光定量一步法RT-PCR检测方法。结果:所建立方法采用dUTP/UDG酶防污染体系,其标准曲线在2.58×10^(1)~2.58×10^(7) copies/μL质粒模板量呈现良好的线性关系,斜率为-3.413,相关系数(R^(2))为0.995,熔解温度T_(M)为(85.5±0.5)℃;该方法对质粒标准品检测灵敏度下限为25.8 copies/μL;该方法特异性检测GoAstV-2,而新城疫病毒(NDV)、H5型禽流感病毒(AIV-H5)、禽呼肠孤病毒(ARV)等11种常见禽传染病病原检测结果均为阴性。重复性试验显示,组内和组间变异系数均小于2%,表明其具有良好的重复性。GoAstV-2感染病死鹅组织定量检测显示,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、小肠、大脑和肌肉组织均可检测出GoAstV-2,其中肾脏病毒含量最高(2.58×10^(11) copies/g),大脑和肌肉组织含毒量较低。32份临床送检病死鹅组织样品的检测显示,9份存在GoAstV-2感染,阳性率为28.1%。结论:EvaGreen荧光定量一步法RT-PCR能高效检测GoAstV-2,可应用于禽类GoAstV-2感染的诊断和净化检测。

黄芪多糖对鸡体液免疫增强作用

为研究提高体液免疫效果和有效降低免疫原剂量的可行性,本研究将黄芪多糖、灭活新城疫病毒及油乳剂按不同比例配制疫苗后分别免疫鸡,以无佐剂苗和油乳苗为对照,分别于免疫后第7、14、21、28、35和48天时,在各免疫组随机抽取10只鸡进行ND-HI抗体效价的检测;将黄芪多糖分成5个浓度加入体外培养的鸡脾脏淋巴细胞中,以MTT法检测其对脾脏淋巴细胞增殖的影响。结果显示,加入不同剂量黄芪多糖的油苗组在一些时间点均能显著提高抗体效价,其中中等剂量组效果最好;加入黄芪多糖0.375 mg/只而疫苗减半组的抗体效价与单纯油苗组相当;黄芪多糖在300 mg/L时能显著促进鸡脾脏淋巴细胞的增殖。黄芪多糖可以作为体液免疫增强剂。

鸡新城疫强毒株的分离及其人工感染试验

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病鸡群中分离到一株病毒 ,经HA、HI试验及血清中和接种鸡胚试验 ,确定为新城疫病毒。参照国际上规定的新城疫病毒毒力判定的标准及其方法 ,测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT)、1日龄鸡脑内接种致病指数 (ICPI)和 6周龄鸡静脉内接种致病指数 (IVPI)分别为 4 4h、1.74和 2 .39。表明该分离株具有与新城疫病毒速发型相类似的毒力 ,属强毒力毒株。用该分离株对 16日龄的鸡、鹅、鸭分别进行了人工试验感染 ,其发病率均为10 0 % ,而死亡率分别为 4 0 %～ 80 %、4 0 %～ 6 0 %和 0。

鸭副粘病毒强毒株的分离和鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病肉鸭群中分离到一株病毒。该毒株对鸡红细胞具有凝集性，并可被康复鸭鸭血清和ＮＤＶ阳性抗血清所抑制，而不能被禽流感标准阳性血清抑制，结合血清中和鸡胚接种试验。病毒回归试验和免疫防治效果的研究结果，确认为鸭副粘病毒。参照国际上规定的新城疫病毒毒力判定的标准及其方法，测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间（ＭＤＴ）、１日龄鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）和６周龄鸡静脉内接种致病指数（ＷＰＩ）分别为４８．９ｈ、１．８０和２．４５。表明该鸭副粘病毒分离株具有新城疫病毒（ＮＤＶ）速发型相类似的毒力，属强毒力毒株，并定名为ＷＦ００Ｄ株。

MDV感染鸡羽毛根病毒抗原和DNA的动态检测

１０羽１４日龄鸡分别以马立克氏病毒（ＭＤＶ）ＢＪ－１株接毒，采集羽毛根作为ＭＤＶ琼扩抗原和ＭＤＶＤＮＡｄｏｔ－ｂｌｏｔ杂交的动态检测样品。接毒后第１０ｄ至第８周的检测结果显示，鸡羽毛根ＭＤＶ琼扩抗原及ＭＤＶＤＮＡ可分别在接毒后第１４ｄ（３７．５％，３／８）和第１２ｄ（３３．３％，３／９）检出；接毒后第１７ｄ至第５周，鸡羽毛根ＭＤＶ琼扩抗原的阳性检出率均大于８０％；第６，７和８周时，则分别降至６６．７％（４／６），５０％（３／６）和４０％（２／５）。而ＭＤＶＤＮＡ的检测，除１只鸡直到第４周才呈阳性外，其余在接毒后第１４ｄ至第８周中均保持１００％的阳性检出率。

免疫鸡MDV感染后羽毛根HVT的分离及HVT免疫对MDV抗原检测的影响

５只ＨＶＴ免疫鸡，实验感染ＭＤＶ后的第１～１０周期间，分别采用初次细胞分离培养物上清中的自由病毒粒子鉴定，ｄｏｔ－ｂｌｏｔＤＮＡ杂交和常规ＡＧＰ试验等方法，对并发感染鸡羽毛根进行了病毒及病毒抗原的动态检测与比较。结果显示，在上述羽毛根中可同时存在ＨＶＴ粒子和ＭＤＶＤＮＡ。ＨＶＴ可分离时间为ＭＤＶ攻毒后１～７周；ＭＤＶＤＮＡ最早检出时间为ＭＤＶ攻毒后的第１８～２２天，并达到其持续性（２２～７０ｄ）的检出率最高峰（１００％）；而ＡＧＰ法对此期间鸡只羽毛根ＭＤＶ抗原的最早检出时间在第２２天，且检出率很低。因此，羽毛病毒抗原ＡＧＰ检测法，对免疫鸡只或鸡群ＭＤＶ感染的诊断仍然是特异的，但较单纯感染的检测，其检出率更低，因而更难以反映出免疫鸡群中ＭＤＶ感染的真实状况。

鸭副粘病毒人工感染鸭的病理组织学研究

为研究鸭副粘病毒致病机理及病理组织变化。本研究将20日龄非免疫健康建湖麻鸭60羽,随机均分为试验组和对照组。试验组鸭皮下接种1:5稀释的鸭副粘病毒WF00D株SPF鸡胚绒尿液0.5mL/羽,对照组鸭皮下注射等量灭菌生理盐水,并分别置于25℃隔离环境下饲养与观察。于接种后第4d、8d、12d、16d和第20d,两组均随机取4羽鸭进行剖检,观察各器官的大体病变,同时,观察病理组织学变化。结果显示:试验组鸭除个体发育呈明显差异外,内脏器官在观察期间均有较轻微的炎性水肿或出血;病理组织学变化主要为器官充血或出血、炎性细胞浸润、细胞颗粒变性;超微病理学变化主要为细胞器变性,胞浆局灶性坏死、线粒体空泡化、粗面内质网脱颗粒。研究表明其病理演变过程具有一定的规律性。本研究为鸭副粘病毒流行规律的探究及致病机理的深入研究提供了依据。

畜禽健康养殖及其生物安全体系的构建

针对我国畜禽养殖方式和水平较为低下这一现状,畜禽疫病的防控不仅要从疫病流行的三个环节加强综合防制,更要在宏观上积极进行动物健康养殖体系及生物安全保障体系的规划、建设与完善。文章从建立和健全各级畜禽防疫体系和兽医卫生监督控制体系及以区域化和标准化的安全养殖小区建设为核心两个方面浅述畜禽健康养殖及其生物安全体系的构建。

免疫鸡羽毛根中火鸡疱疹病毒的分离与鉴定

用常规剂量的商用火鸡疱疹病毒（ＨＶＴ）冻干苗经腹腔免疫１日龄非免疫鸡，于第３周采集羽毛根，分别采取直接法和间接法（即经过滤获取脱细胞的游离物）接种次代鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），以进行病毒的分离。结果显示，在免疫后第３、４、５、６周，２种方法都分离到病毒，第７周仅直接法分离到病毒，而第８周２种方法都没有分离到。根据分离到病毒的细胞病变（ＣＰＥ）特征，结合地高辛标记的Ⅰ型马立克氏病病毒（ＭＤＶ－１）核酸探针检测结果，表明ＨＶＴ免疫鸡羽毛根中含有可脱离细胞的、具有感染性的疫苗株ＨＶＴ粒子，且其可检出时间具有阶段性。

HVT免疫鸡羽毛根中病毒抗原的检测

１日龄非免疫鸡，ＨＶＴ常规剂量免疫后，于第３周起，每周采集一次羽毛根，分别作常规ＭＤＶ琼扩抗原的检测，结果显示：在免疫后第３～８周检测，均未观察到特异性ＡＧＰ沉淀线；若取较多数量的富含羽髓的羽毛根，经２ｍｌ磷酸缓冲液（ＰＢＳ）浸提、浓缩胶浓缩约４０倍后，再作上述检测，则分别于免疫接种后的第３～５周都有特异性的ＡＧＰ沉淀线出现，且与感染细胞上清中浓缩的ＨＶＴ及ＭＤＶ琼扩抗原所形成的沉淀线基本吻合，而第６周检测时，仅与ＨＶＴ阳性血清呈微弱阳性，用同样方法对免疫后第６周后的检测结果均表明为阴性。由此推断，免疫鸡羽毛根中含有较低水平的、并与致病性ＭＤＶ抗原具有交叉反应性的ＨＶＴ琼扩抗原，但采用常规ＡＧＰ法不能直接检测到。

鸭胚成纤维细胞培养方法的初步建立

在鸭胚成纤维细胞 (DEF)的制备及单层维持过程中 ,通过对不同消化方式 ,营养液的不同pH值 ,不同血清浓度对细胞生长及维持的影响 ,摸索出一种比较经济实用的培养方法 :细胞增殖时 ,最低血清浓度在 5 %左右、pH6 .8～ 7.2时 ,生长状态较佳 ;维持细胞时 ,血清浓度在 1～ 2 %、pH值在 7.4～ 7.6时较好。添加L -谷氨酰胺后 。

几种抗氧化剂对菜籽油的抗氧化效果的研究

采用烘箱贮藏法 ,以菜籽油为底物 ,测定了几种抗氧化剂的抗氧化活性 ,结果显示 ,植酸有很强的抗氧化活性 ,略优于丁基羟基茴香醚 (BHA) ,但明显优于乙氧基喹啉 (EQ)。

鹅副粘病毒的分离与鉴定

采用鸡胚接种法从安徽凤阳某患病鹅群中分离到一株病毒。经HA与HI试验、血清中和接种鸡胚试验、病毒回归试验确认为鹅副粘病毒 ,并命名为WF0 0 G株。参照新城疫病毒毒力判定的标准及其方法 ,测定该分离株的鸡胚最小致死量平均死亡时间 (MDT)、1日龄鸡脑接种致病指数 (ICPI)和 6周龄鸡静脉内接种致病指数 (IVPI)分别为 4 4 8h、1 81和 2 32 ,结果表明该分离株具有与新城疫病毒 (NDV)速发型相类似的毒力 ,属强毒力毒株。

基因探针技术检测血清1型马立克氏病病毒的研究

选用马立克氏病病毒（MDV）GA株BamHI基因文库中LDNA片段，制成DIG—标记的MDV核酸探针，分别对1型MDV强毒株（BJ-1株）和弱毒株（Md11／75c株）感染材料的核酸进行dotblot杂交检测，结果显示均有阳性呈色反应；而对MDV血清2型（SB-1株）、3型（Fe126株）及禽网状内皮组织增殖病病毒（REV）和淋巴细胞性白血病病毒（LLV）感染细胞的核酸，作上述同样检测，则均未见任何颜色显现。

羽毛根中MDV抗原和抗体的检测

HVT注苗鸡和未注苗鸡．分别以AIDV强毒接种感染和同居感染，用琼脂扩散试验（AGPT）检测各鸡群不同时期羽囊MDV抗原和抗体。结果显示，HVT苗可使实验鸡羽囊中MDV抗原检出时间推迟，阳性检出率显著降低：而羽囊中MDV抗体检出情况与此正好相反，检出时间早，阳性率高。

中药制剂抗IBDV效果的观察

选用金蓝、黄花两种中药注射液 ,在非免疫鸡胚中进行抗IBDV效果试验 ,黄花和金蓝注射液在 5 0 0倍稀释浓度下 ,均具有抗IBDV作用 ,接种病毒后混合组试验中鸡胚平均存活 15 4h ,177h(P <0 .0 5 ) ,抑制组试验中平均存活 62h ,68.7h(P >0 .0 5 ) ,预防组实验中鸡胚被孵出 ,病毒对照组则平均存活只有 4 5h。

草石蚕多糖提取纯化工艺研究

探讨草石蚕多糖提取及纯化工艺,通过单因素和正交实验摸索提取条件,应用超滤技术进行纯化,最终确立了草石蚕多糖最佳提取工艺:提取温度为60℃,时间为1h,料液比为1∶30,在此条件下草石蚕多糖的提取率为53·86%,草石蚕提取液经截留分子量为3kD的中空纤维膜超滤处理后,其透过率为76·2%,透过液多糖纯度达77·0%,用薄层层析(TLC)鉴定其透过液的主要成分为水苏糖。

几种单糖、寡糖TLC条件的确立及草石蚕寡糖中水苏糖含量测定

目的:建立薄层色谱(TLC)分析几种单糖、寡糖的有效方法,并测定草石蚕寡糖中水苏糖含量。方法:以果糖、蔗糖、棉子糖和水苏糖为研究对象,从斑点分离度、斑点集中与否、有无拖尾现象及展开时间几方面探讨其在不同体系下的薄层色谱行为;通过薄层色谱扫描(TLCS)测定草石蚕寡糖中水苏糖含量。结果:确立适合的展开系统为乙酸乙酯/甲醇/水/冰乙酸(11.5:3.2:2:3.2),合适的显色剂为茴香醛-浓硫酸显色剂;草石蚕寡糖中水苏糖含量为69.3%。