拟穴青蟹两个Crustin新变体的克隆与表达分析

Crustins是一类广泛存在于甲壳动物中富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽.该研究从拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)中克隆获得两个Crustin新变体,分别命名为SpCrus1b和SpCrus2b.分析显示两者的前体肽包含N-端信号肽和C-端成熟肽两部分,成熟肽均含有12个位置高度保守的半胱氨酸.SpCrus1b在信号肽和乳清酸蛋白(WAP)结构域之间存在一个半胱氨酸富集区,属于典型的Ⅰ型Crustins;SpCrus2b除具有SpCrus1b的结构特征外,在近N-端额外含有一个甘氨酸富集区,属于典型的Ⅱ型Crustins.基因组结构分析显示SpCrus1b的基因组DNA序列为4个外显子/3个内含子结构,而SpCrus2b的基因组DNA序列为2个外显子/1个内含子结构.两者均主要在鳃中表达,且在脂多糖(LPS)刺激24h和聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激12h后表达量均极显著上调(p<0.01),表明SpCrus1b和SpCrus2b参与了拟穴青蟹抗细菌和抗病毒的先天免疫过程.

拟穴青蟹抗菌肽Crustin新变体的表达特性与抗菌功能

Crustins是一类较早发现并广泛分布在甲壳动物中且富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,能够参与抗菌免疫应答.从拟穴青蟹( Scylla paramamosain )中克隆获得一个 Crustin 基因新变体,命名为 SpCrus1a ,其cDNA序列全长744 bp,开放阅读框编码113个氨基酸,成熟肽分子质量10.03 ku,理论等电点8.30.表达分析结果发现其转录本主要存在于鳃、卵巢、上皮组织中,经脂多糖刺激后 SpCrus1a 表达会上调.体外合成 Sp Crus1a 的第29~47位氨基酸( Sp Crus1a 29-47 )进行抗菌活性实验,发现其对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性,而对被测的革兰氏阴性菌抗菌活性较弱或无抗菌活性.浓度24 μmol/L的合成肽 Sp Crus1a 29-47 能够在5 min内杀死大多数的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),在120 min内杀死全部的金黄色葡萄球菌.扫描电镜分析发现合成肽 Sp Crus1a 29-47 可造成金黄色葡萄球菌表面结构崎岖不平,高浓度 Sp Crus1a 29-47 会引起细菌大量死亡.上述结果表明 Sp Crus1a是抗菌肽Crustin的新变体.