羟基红花黄色素A通过影响PCNA表达和MEK-ERK1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的探讨羟基红花黄色素A(HYSA)影响增殖细胞核抗原(PCNA)表达和MEK-ERK1/2信号通路抑制血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的分子机制。方法采用贴块法培养大鼠血管平滑肌细胞,用血小板源生长因子(PDGF)诱导其增殖,采用MTT法检测HYSA对平滑肌细胞增殖的抑制作用;采用Western blot和免疫组织化学方法检测HYSA对PCNA表达及对MEK-ERK1/2信号通路的影响。结果HYSA浓度依赖性地抑制PDGF诱导的VSMC增殖,降低PCNA的表达,阻断PDGF受体的激活和MEK/ERK信号通路的活化,但不影响JNK和p38MAPK的活性。结论 HYSA通过降低PCNA表达和阻断MEK-ERK1/2信号通路抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖。

同型半胱氨酸通过抑制心肌线粒体自噬诱导线粒体损伤

本研究旨在探究同型半胱氨酸(Hcy)与心肌细胞线粒体自噬及线粒体损伤的关系。通过高蛋氨酸饮食法构建高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠模型,利用免疫荧光共定位染色法和Western blot检测HHcy大鼠心肌的线粒体自噬水平。运用透射电镜观察HHcy大鼠心肌的线粒体形态结构的改变。体外培养H9C2细胞,用Hcy刺激H9C2,利用流式细胞术和JC-1染色法检测线粒体膜电位(MMP)的改变。采用18F-FDG PET/CT在体心肌代谢成像技术检测心肌葡萄糖摄取情况以及直接检测心肌组织的三磷酸腺苷(ATP)含量来评价HHcy大鼠心肌的能量供应情况。结果显示,与正常对照组相比,在HHcy大鼠模型心肌组织中,线粒体自噬水平降低;线粒体排列紊乱,轮廓模糊,膜破损溶解,嵴消失;Hcy刺激的H9C2细胞,线粒体膜电位降低,膜结构完整性受损。HHcy大鼠心肌葡萄糖摄取率增加,ATP含量下降。结果提示,同型半胱氨酸可通过抑制心肌线粒体自噬诱导线粒体损伤。

硝化应激参与同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞自噬降低

本研究旨在探讨硝化应激与同型半胱氨酸(Hcy)诱导血管内皮细胞自噬降低之间的关系。利用饮食法建立高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠模型,利用免疫组织化学染色法分别检测大鼠胸主动脉自噬相关蛋白及硝化应激相关蛋白的表达。体外培养人脐静脉内皮细胞,用Hcy刺激内皮细胞,提取细胞蛋白,检测自噬相关蛋白及硝化应激相关蛋白的表达。利用Fe TMPyP预处理Hcy刺激的HUVECs细胞,检测上述相关蛋白表达的变化。结果显示HHcy大鼠模型建立成功,同时其胸主动脉LC3表达下降,p62表达增加,NT表达增加; Hcy处理的HUVECs自噬水平明显降低,而Fe TMPyP预处理能够降低NT表达,逆转Hcy导致的细胞自噬水平降低。本研究表明硝化应激参与了同型半胱氨酸诱导的血管内皮细胞自噬降低。

羟基红花黄色素A可抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的 探讨羟基红花黄色素A（HSYA）对血管平滑肌细胞（VSMC）增殖的影响及其机制.方法 取清洁Ⅱ级雄性（Sprague Dawley,SD）大鼠腹主动脉,采用贴块法培养VSMC,DMEM培养基正常培养的VSMC为空白对照组、含有10 ng/ml PDGF培养基培养的VSMC为PDGF刺激组（PDGF组）、含有10 ng/ml PDGF培养基加入不同浓度的HSYA干预的VSMC为HSYA不同浓度组（HYSA 浓度分别为1、5、10、20、40及60 μmol/L）.采用MTT法分析不同浓度的HSYA对VSMC增殖的影响.采用蛋白印迹法检测各组增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达水平及跨膜信号转导蛋白分子的磷酸化水平.采用免疫细胞化学法检测各组PCNA的表达.结果 HSYA不同浓度（1、5、10、20、40及60 μmol/L）组VSMC增殖水平均低于PDGF组（P均＜0.05）,且呈浓度依赖性.HYSA不同浓度（5、10、20及40 μmol/L）组PNCA蛋白表达水平均低于PDGF组（P均＜0.05）.PDGF组PDGFR磷酸化水平明显高于空白对照组（P＜0.05）,而HSYA不同浓度（5、10、20及40 μmol/L）组则均低于PDGF组,且呈浓度依赖性（P均＜ 0.05）.PDGF组MEK和ERK1/2磷酸化水平均明显高于空白对照组（P均＜0.05）,而HSYA不同浓度（5、10、20及40 μmol/L）组则均低于PDGF组,且呈浓度依赖性（P均＜0.05）.结论 HSYA可抑制VSMC增殖、降低PCNA表达,其可能是通过阻断MEK/ERK1/2信号通路抑制大鼠VSMC增殖的.

内源性一氧化氮对血管内皮细胞超氧化物歧化酶1活性及细胞凋亡的影响

目的探讨内源性一氧化氮(NO)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)超氧化物歧化酶1(SOD1)活性及内皮细胞凋亡的调节作用。方法以HUVECs为研究对象,采用内皮型一氧化氮合酶(eNOS)短发夹RNA(shRNA)慢病毒转染对内皮细胞eNOS进行敲低,HUVECs分为4组:空载体组(scramble)、转染eNOS shRNA组(eNOS shRNA)、转染eNOS shRNA+硝普钠(SNP)组(eNOS shRNA+SNP)及转染eNOS shRNA+SNP+三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)组(eNOS shRNA+SNP+TCEP)。采用Western blot法检测eNOS蛋白表达和SOD1二聚体/单体蛋白表达,采用酶联免疫吸附法检测SOD酶活性,采用NO荧光探针法检测内皮细胞NO水平,采用二氢乙锭(DHE)检测内皮细胞超氧化物阴离子水平,采用原位末端转移酶标记技术检测内皮细胞凋亡情况。结果与空载体组相比,eNOS shRNA组中内源性NO水平(2.690±0.420比15.029±2.193,P<0.01)、eNOS蛋白表达(1.000±0.778比3.141±0.199,P<0.01)、SOD1二聚体/单体比例(4.6±1.0比7.6±2.0,P<0.05)和SOD活性[(0.432±0.254)Carmen′s unit/10^(4) cell比(1.000±0.116)Carmen′s unit/10^(4) cell,P<0.01]均显著降低,细胞内超氧阴离子水平(11.180±1.560比6.146±1.007,P<0.01)和HUVECs凋亡水平[75.0(55.0,100.0)%比0(0,0)%,P<0.01]均显著增加。与eNOS shRNA组相比,eNOS shRNA+SNP组中内源性NO含量(16.705±0.116比2.690±0.420,P<0.01)、SOD1二聚体/单体比例(7.3±2.0比4.6±1.0,P<0.05)和SOD活性[(0.737±0.060)Carmen′s unit/10^(4) cell比(0.432±0.254)Carmen′s unit/10^(4) cell,P<0.05]均显著增加,细胞内超氧阴离子水平(6.897±1.648比11.180±1.560,P<0.01)和HUVECs凋亡水平[0(0,0)%比75.0(55.0,100.0)%,P<0.01]均显著下降。与eNOS shRNA+SNP组相比,eNOS shRNA+SNP+TCEP组中SOD1二聚体/单体比例(4.4±0.9比7.3±2.0,P<0.05)和SOD活性[(0.214±0.084)Carmen′s unit/10^(4) cell比(0.737±0.060)Carmen′s unit/10^(4) cell,P<0.01]均显著降低,超氧阴离子水平(10.917±1.552比6.897±1.640,P<0.01)和HUVECs凋亡水平[63.6(55.0,90.0)%比0(0,0)%,P<0.01]均显著增加;但NO水平(16.112±0.926比16.705±0.116,P>0.05)无明显变化。结论内源性NO通过上调SOD1二聚体/单体比例,增强SOD活性,抑制活性氧积累,从而有效对抗人脐静脉内皮细胞凋亡。