CREB对添加食欲素A体外培养的绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮的影响

为探讨食欲素A（orexin A）影响绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮是否受环磷酸腺苷（cAMP）及其下游环磷酸腺苷效应原件结合蛋白（CREB）的调节,体外培养绵羊卵巢颗粒细胞并进行姬姆萨染色、卵泡刺激素受体免疫荧光染色鉴定后,采用细胞免疫组化手段对CREB的存在及位置做出确定。经黄体化处理后分组添加不同浓度（10 nmol/L、100 nmol/L、1 mol/L）的食欲素A受体阻断剂（HY-10805A）孵育2 h,再添加不同浓度（10 nmol/L、58 nmol/L）的食欲素A,运用ELISA方法检测细胞内cAMP浓度的变化。在细胞培养液里添加不同浓度（100 nmol/L、1 mol/L、10 mol/L）的CREB抑制剂（HY-101120）孵育2 h,后添加相同浓度（10 nmol/L）的食欲素A,运用ELISA方法检测细胞培养上清液中孕酮的浓度。结果显示,姬姆萨染色后,可见长梭形或不规则星形卵巢颗粒细胞,细胞着色均匀,胞浆淡蓝色,细胞核深蓝色。免疫组化试验组细胞形态清晰,胞核呈黄色,胞浆无染色。添加食欲素A受体阻断剂组与对照组相比,cAMP的浓度显著降低（P〈0.01）,不同浓度CREB抑制剂组与对照组相比,孕酮含量均下降,且下降趋势在其浓度为10 mol/L时达到最高（P〈0.01）。结果表明,绵羊卵巢颗粒细胞中存在CREB,且浓储于细胞核,外加食欲素A可影响绵羊卵巢颗粒细胞cAMP的含量,而在阻断其下游原件CREB后,孕酮分泌明显受到影响,说明CREB对绵羊卵巢颗粒细胞的孕酮分泌有影响。

食欲素A对绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮以及cAMP含量的影响

为了解食欲素A对绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮以及cAMP浓度的影响,通过食欲素A刺激体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞,采用HE染色和免疫荧光观察促卵泡激素受体(folicle-stimulating hormone receptor,FSHR)蛋白表达的方法进行鉴定,并经黄体化处理,添加不同浓度(1 nmol/L,10 nmol/L,58 nmol/L,100 nmol/L或145 nmol/L)的食欲素A分别处理0、24、48、72 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测细胞培养上清液孕酮浓度。结果表明,HE染色后镜下可见梭形或不规则星形的卵巢颗粒细胞,细胞核呈深蓝色,胞浆呈淡粉色。免疫荧光结果显示FSHR呈阳性表达,细胞纯度达90%以上。绵羊卵巢黄体化颗粒细胞添加食欲素A,同一时间孕酮分泌量随食欲素浓度的增加呈逐渐升高然后下降的趋势,且添加浓度在10 nmol/L时孕酮分泌量达到最高;添加同一浓度的食欲素A,随着作用时间的延长孕酮分泌量呈逐渐升高然后下降的趋势,且时间在24 h时分泌量达到最高。在进一步的研究中,体外培养绵羊卵巢颗粒细胞,经黄体化处理,添加不同浓度的食欲素A受体阻断剂(HY-10805A)(10 nmol/L,100 nmol/L,1 mol/L)孵育2 h,添加不同浓度(10nmol/L,58 nmol/L)的食欲素A孵育24 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测细胞裂解上清中cAMP浓度变化。结果表明:添加食欲素受体阻断剂组与对照组相比c AMP的浓度显著降低(P<0.01)。以上结果说明绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮受食欲素A的浓度及时间变化影响,并且能够影响细胞中cAMP的含量。

基于RNA-Seq分析食欲素A对绵羊卵巢黄体化颗粒细胞基因表达的影响

食欲素A(orexin A)作为一种重要的神经肽类激素,通过与G蛋白耦联受体结合影响生殖功能。为了研究orexin A对绵羊黄体化颗粒细胞基因表达的影响及其信号网络,培养绵羊卵巢黄体化颗粒细胞进行鉴定,提取黄体化颗粒细胞组和添加Orexin A的黄体化颗粒细胞组的RNA,采用lllumina测序技术进行测序,利用生物信息学方法对转录组数据进行分析,在测序数据质量控制的基础上,对差异表达的基因进行筛选、功能注释和富集分析。结果表明,黄体化颗粒细胞组的孕酮分泌量显著高于未黄体化颗粒细胞组;转录组测序共获得了50个差异基因,其中上调表达20个,下调30个;发现多个与细胞周期调控、繁殖及代谢相关的高表达基因,如PRRT2、ID1、RRM2、ATP6、ATP8、KIRREL、SOX4、TBX3等基因,结合GO分析和KEGG通路分析表明,差异基因主要参与代谢途径、氧化磷酸化、癌症信号通路、GnRH信号通路、cGMP-PKG信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路以及Ca离子信号通路等。本试验为进一步阐明orexin A影响绵羊的生殖调控提供了依据。