毕赤酵母新启动子GCW14在细胞表面展示CALB中的应用

以毕赤酵母内源壁蛋白Gcwl4p为锚定蛋白,分别以新的内源组成型启动子P_(GCW14)与诱导型启动子P_(AOXI)、组成型启动子P_(GAP)和P_(TEF1)4种启动子将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)展示于毕赤酵母细胞表面,通过检测4种重组细胞的CALB酶活比较这4个启动子在毕赤酵母中的转录活性。结果显示,P_(GCW14)的启动子活性与P_(AOX1)相当,最高菌体酶活力分别在发酵48 h和168h时达到694.8 U/g(Dry cell weight)和684.3 U/g(Dry cell weight),以P_(GCW14)为启动子的重组菌产酶周期大大缩短;组成型启动子P_(GAP)和P_(TEF1)的最高菌体酶活分别在发酵24 h和168 h达到266.7 U/g(Dry cell weight)和449.2 U/g(Dry cell weight),可见P_(GCW14)的启动子活力性要高于P_(GAP)和P_(TEF1)。此外,以P_(GCW14)为启动子,利用壁蛋白Gcw14p自身的信号肽代替载体上的α-信号肽使重组菌的菌体酶活力提高了约4%。

AEG-1表达下调对脑胶质瘤U373细胞的放射增敏效应

目的:探讨AEG-1基因表达下调对人脑胶质瘤细胞U373放射敏感性的影响。方法:以人MTDH/AEG-1(NM-178812)为靶标设计shRNA序列,慢病毒介导将AEG-1 shRNA转染至胶质瘤U373细胞中。荧光定量PCR及Western blot测定转染前后AEG-1 mRNA及蛋白的表达;克隆形成实验评估AEG-1基因下调后U373细胞放射敏感性;流式细胞术检测AEG-1下调后U373细胞凋亡及细胞周期分布。结果:通过慢病毒介导的shRNA转染,构建了AEG-1表达稳定下调的U373-shAEG-1细胞系,有效抑制了胶质瘤U373细胞中AEG-1的表达(抑制率84%,P<0.05),增加了凋亡细胞的比例(13.07%±0.28%,P<0.05),并提高细胞周期中S期细胞比例(58.18%,P<0.01),且AEG-1基因表达下调后U373细胞的D0值(1.60Gy)和Dq值(1.06Gy)均明显低于空白对照组及阴性对照组细胞(P<0.05)。结论:下调AEG-1可以增强人脑胶质瘤U373细胞的放射敏感性,其机制与诱导细胞凋亡及干预细胞周期分布有关。