一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

目的：建立一种简便、高效，可一步完成多个片段连接，从而构建含同源臂的载体的方法。方法：按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物，在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例，PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19－T等4个片段，纯化后一起加入一个反应管中，并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液，进行酶切、酶连接共10～50个循环反应，一步构建含同源臂载体的质粒；产物经高温处理后，直接转化感受态细胞，并进行重组子PCR鉴定；对pMD19－T载体进行优化，突变载体上的BsaⅠ酶切位点，把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298－T载体，再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果：重组质粒酶切和PCR结果表明，应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体；用优化后的pMD19－T－O载体体系，在2d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论：多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠，不仅可快速构建某类载体系统，还可对基因进行精确的点突变，该系统可用于快速构建基因打靶载体。

稳定表达牛催乳素基因的小鼠乳腺上皮细胞系的建立

在乳腺上皮细胞体外培养时,为了使其状态接近泌乳期,需要在培养基中添加催乳素.由于催乳素价格昂贵,使得乳腺上皮细胞的体外培养成本颇高.建立在体外培养过程中不需要添加催乳素蛋白的乳腺上皮细胞系,能为在细胞水平研究乳腺细胞相关基因提供诸多方便.利用慢病毒载体的整合特性,建立稳定整合了牛催乳素cDNA(bPRL)表达盒的小鼠乳腺上皮细胞系(HC11细胞系).经10代次以上的传代以后,通过定量PCR检测,证明平均每个细胞中含有2.6个外源的bPRL基因,其表达量为HC11细胞中管家基因β-肌动蛋白(β-actin)表达量的14%左右.另外,先前的研究结果表明催乳素能在HC11和泌乳期的小鼠乳腺上皮组织中有效促进山羊β-酪蛋白启动子启动外源基因的表达.之后的实验证实整合了催乳素基因的HC11细胞(bPRL-HC11细胞系)也有此功能.因此,bPRL-HC11细胞系可以为体外研究乳腺生物反应器提供良好的细胞模型.

基于DNA自组装级联反应的纳米开关的构建

DNA纳米技术是纳米科学领域的一门新兴学科,它是依据DNA的碱基互补配对原则通过自组装行为构建成为各种维度的空间结构,具有长远的开发应用价值。DNA折纸术是一种新型DNA自组装方法,它通过向一条长的DNA骨架链上加入一系列经过特殊设计的短的DNA片段(订书钉链),依据碱基互补原则,可以构建出各种各样的二维三维DNA纳米结构。以往的纳米开关研究已经实现了人体重要微量元素的灵敏检测,而DNA纳米开关由于其具有良好的生物相容性和无毒性,有望实现更为广泛和安全的生物医学应用。本论文的主要研究是通过在骨架链—噬菌体M13mp18单链DNA上加入特定的订书钉链进而构建出能够进行数据输入的纳米开关结构,并通过特定的数据链实现级联反应的数据处理功能,该级联反应结果最终通过凝胶电泳解读。我们展示了通过加入不同的数据链精确控制纳米开关形成的环状结构数目和纳米开关反应的位置。该纳米开关构建过程十分简单,只需要在室温下进行DNA链杂交反应,结果采用凝胶电泳即能展示。由于该纳米开关构造的简易性和安全性,该纳米开关结构在一方面有望实现生物医学的数据记忆和存储的功能,而在另一方面该结构在药物的靶向运输和治疗方面也有着巨大的潜在应用价值。

TALENs:一种新的基因定点修饰技术

转录激活因子样效应蛋白核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN),由TALE(transcription activator-like effector)结构域和Fok I核酸内切酶结构域人工融合而成,它是近几年发展起来的一种可对基因组定点改造的新技术。TALEN能够特异识别一段DNA序列,并能够对双链DNA进行切割,TALEN造成DNA断裂后可以启动细胞对DNA的修复,从而实现特定位点的基因操作如基因敲除、基因敲进、基因修复等。相比ZFNs,TALENs的获得更为容易、效果更为明显,它在理论上真正实现了对任意序列进行基因操作的可能。综述了TALEN技术的研究发展过程、结构与作用机制、构建TALEN的方法,以及目前这一技术的应用等。

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区(pBLG)表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法:构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ(pCAG-loxPPolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ)。转染细胞实验结果:PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞(HC11)中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论:构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。